mikrobiologiia

71

ЛЕКЦИЯ 11. ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

План: 1.Температура

2.Лучистая энергия.

3.Электромагнитные колебания и ультразвук.

4.Влажность

5.Осмотическое давление

1. Температура Температура - один из основных факторов, определяющих возможность и

интенсивность размножения микроорганизмов.

Микроорганизмы могут расти и проявлять свою жизнедеятельность в определенном температурном диапазоне, и в зависимости от отношения к температуре делятся на психрофилы, мезофилы и термофилы. Температурные диапазоны роста и развития микроорганизмов этих групп приведены в таблице

2.

Разделение микроорганизмов на 3 группы весьма условно, так как микроорганизмы могут приспосабливаться к несвойственной им температуре.

Температурные пределы роста определяются терморезистентностью ферментов и клеточных структур, содержащих белки.

Среди мезофилов встречаются формы с высоким температурным максимумом и низким минимумом. Такие микроорганизмы называют

термотолерантными.

Таблица 2 - Температурные диапазоны роста и развития микроорганизмов разных групп

Действие высоких температур на микроорганизмы.

Повышение температуры выше максимальной может привести к гибели клеток. Гибель микроорганизмов наступает не мгновенно, а во времени. При незначительном повышении температуры выше максимальной микроорганизмы могут испытывать«тепловой шок» и после недлительного пребывания в таком состоянии они могут реактивироваться.

72

Механизм губительного действия высоких температур связан с денатурацией клеточных белков. На температуру денатурации белков влияет содержание в них воды (чем меньше воды в белке, тем выше температура денатурации). Молодые вегетативные клетки, богатые свободной водой погибают при нагревании быстрее, чем старые, обезвоженные.

Термоустойчивость - способность микроорганизмов выдерживать длительное нагревание при температурах, превышающих температурный максимум их развития.

Гибель микроорганизмов наступает при разных значениях температур и зависит от вида микроорганизма. Так, при нагревании во влажной среде в течение 15 мин при температуре 50-60 °С погибает большинство грибов и дрожжей; при 60-70 °С - вегетативные клетки большинства бактерий, споры грибов и дрожжей уничтожаются при 65-80° С. Наибольшей термоустойчивостью обладают вегетативные клетки термофилов (90-100 °С) и споры бактерий (120 °С).

Высокая термоустойчивость термофилов связана с тем, что, во первых, белки и ферменты их клеток более устойчивы к температуре, во вторых, в них содержится меньше влаги. Кроме того, скорость синтеза различных клеточных структур у термофилов выше скорости их разрушения.

Термоустойчивость спор бактерий связана с малым содержанием в них свободной влаги, многослойнойоболочкой, в состав которой входит кальциевая соль дипиколиновой кислоты.

На губительном действии высоких температур основаны различные методы уничтожения микроорганизмов в пищевых продуктах. Это кипячение, варка, бланширование, обжарка, а также стерилизация и пастеризация. Пастеризация – процесс нагревания до 100˚С при котором происходит уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов. Стерилизация - полное уничтожение вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Процесс стерилизации ведут при температуре выше 100 °С.

Влияние низких температур на микроорганизмы.

К низким температурам микроорганизмы более устойчивы, чем к высоким. Несмотря на то, что размножение и биохимическая активность микроорганизмов при температуре ниже минимальной прекращается, гибели клеток не происходит, т. к. микроорганизмы переходят в состояние анабиоза (скрытой жизни) и остаются жизнеспособными длительное время. При повышении температуры клетки начинают интенсивно размножаться.

Причинами гибели микроорганизмов при действии низких температур

являются:

•нарушение обмена веществ;

•повышение осмотического давления среды вследствие вымораживания

воды;

•в клетках могут образоваться кристаллики льда, разрушающие клеточную стенку.

73

Низкая температура используется при хранении продуктов в охлажденном состоянии (при температуре от 10 до -2 °С) или в замороженном виде (от -12 до

-30 °С).

2. Лучистая энергия.

В природе микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Свет необходим для жизнедеятельности фототрофов. Хемотрофы могут расти и в темноте, а при длительном воздействии солнечной радиации эти микроорганизмы могут погибнуть.

Воздействие лучистой энергии подчиняется законам фотохимии:

изменения в клетках могут быть вызваны только поглощенными лучами.

Следовательно, для эффективности облучения имеет значение проникающая способность лучей, которая зависит от длины волны и дозы.

Доза облучения свою очередь определяется интенсивностью и временем воздействия. Кроме того, эффект воздействия лучистой энергии зависит от вида микроорганизма, характера облучаемого субстрата, степени обсемененности его микроорганизмами, а также от температуры.

Низкие интенсивности видимого света (350-750 нм) и ультрафиолетовых лучей (150-300 нм), а также низкие дозы ионизирующих излучений либо не влияют на жизнедеятельность микроорганизмов, либо приводят к ускорению их роста и стимуляции метаболических процессов, что связано с поглощением квантов света определенными компонентами или веществами клеток и переходом их в электронно-возбужденное состояние.

Более высокие дозы излучений вызывают торможение отдельных процессов обмена, а действие ультрафиолетовых и рентгеновских лучей может привести к изменению наследственных свойств микроорганизмов мутациям, что широко используется для получения высокопродуктивных штаммов.

Гибель микроорганизмов под действием ультрафиолетовых лучей связана

:

•с инактивацией клеточных ферментов;

•с разрушением нуклеиновых кислот;

•с образованием в облучаемой среде перекиси водорода, озона и т.д. Следует отметить, что наиболее устойчивыми к действию

ультрафиолетовых лучей являются споры бактерий, затем споры грибов и дрожжей, далее окрашенные (пигментированные) клетки бактерий. Наименее устойчивы вегетативные клетки бактерий.

Гибель микроорганизмов под действием ионизирующих излучений вызвана:

•радиолизом воды в клетках и субстрате. При этом образуются свободные радикалы, атомарный водород, перекиси, которые, вступая во взаимодействие с другими веществами клетки, вызывают большое количество реакций, не свойственных нормально живущей клетке;

•инактивацией ферментов, разрушением мембранных структур, ядерного аппарата.

Радиоустойчивость различных микроорганизмов колеблется в широких пределах, причем микроорганизмы значительно радиоустойчивей высших

74

организмов (в сотни и тысячи раз). Наиболее устойчивы к действию ионизирующих излучений споры бактерий, затем грибы и дрожжи и далее бактерии.

Губительное действие ультрафиолетовых и рентгеновских γ-лучей используется на практике.

Ультрафиолетовыми лучами дезинфицируют воздух холодильных камер, лечебных и производственных помещений, используют бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей для дезинфекции воды.

Обработка пищевых продуктов низкими дозами гамма-излучений называется радуризацией.

3. Электромагнитные колебания и ультразвук.

Радиоволны.

Это электромагнитные волны, характеризующиеся относительно большой длиной – от миллиметров до километров и частотами от 3·104до 3·1011 герц.

Прохождение коротких и ультрарадиоволн через среду вызывает возникновение в ней переменных токов высокой (ВЧ) и сверхвысокой частоты (СВЧ). В электромагнитном поле электрическая энергия преобразуется в тепловую.

Гибель микроорганизмов в электромагнитном поле высокой интенсивности наступает в результате теплового эффекта, но полностью механизм действия СВЧ-энергии на микроорганизмы не раскрыт.

В последние годы сверхвысокочастотная электромагнитная обработка пищевых продуктов все более широко применяется в пищевой промышленности (для варки, сушки, выпечки, разогревания, размораживания, пастеризации и стерилизации пищевых продуктов). По сравнению с традиционным способом тепловой обработки время нагревания СВЧ-энергией до одной и той же температуры сокращается во много раз, в связи с чем полнее сохраняются вкусовые и питательные свойства продукта.

Ультразвук.

Ультразвуком называют механические колебания с частотами более 20000 колебаний в секунду (20 кГц).

Природа губительного действия ультразвука на микроорганизмы связана:

•с кавитационным эффектом. При распространении в жидкости УЗ-волн происходит быстро чередующееся разряжение и сжатие частиц жидкости. При разряжении в среде образуются мельчайшие полые пространства - «пузырьки», заполняющиеся парами окружающей среды и газами. При сжатии, в момент захлопывания кавитационных «пузырьков», возникает мощная гидравлическая ударная волна, вызывающая разрушительное действие;

•с электрохимическим действием УЗ-энергии. В водной среде происходит ионизация молекул воды и активация растворенного в ней кислорода. При этом образуются вещества, обладающие большой реакционной способностью, которые обуславливают ряд химических процессов, неблагоприятно действующих на живые организмы.

75

Благодаря специфическим свойствам ультразвук все более широко применяют в различных областях техники и технологии многих отраслей народного хозяйства. Ведутся исследования по применению УЗ-энергии для стерилизации питьевой воды, пищевых продуктов (молока, фруктовых соков, вин), мойки и стерилизации стеклянной тары.

4. Влажность.

Влажность среды оказывает большое воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Вода входит в состав клеток и поддерживает тургорное давление в них. Кроме того, питательные вещества проникают внутрь клетки лишь в растворенном состоянии. Обезвоживание субстрата приводит к задержке развития микроорганизмов (состояние анабиоза). При повышении влажности жизнедеятельность микроорганизмов восстанавливается.

Микроорганизмы в зависимости от отношения к влажности делятся на гидрофиты (влаголюбивые), ксерофиты (сухолюбивые) и мезофиты

(средневлаголюбивые). Для большинства бактерий минимальная влажность субстрата 20-30%, а для грибов - 11-13%.

Для развития микроорганизмов важна не абсолютная величина влажности, а ее доступность. Доступность содержащейся в субстрате влаги носит название активность воды (аw). Этот показатель выражает отношение давления паров над субстратом (Рс) к давлению паров над чистой водой (Р) при одной и той же температуре:

аw = Рс/Р

Активность воды лежит в интервале от 0 до 1 и характеризует относительную влажность.

Микроорганизмы могут осуществлять жизнедеятельность при активности воды от 0,999 до 0,62.

Существуют различные пути снижения активности воды: сушка, вяление. В сухом виде хранят муку, крупу, сухофрукты и т.д. При хранении таких продуктов необходимо соблюдать определенную температуру и влажность.

5. Осмотическое давление

Осмотическое давление (концентрация растворенных веществ в среде). Осмотическое давление внутри клеток микроорганизмов несколько выше, чем в среде. Это является условием нормальной жизнедеятельности микроорганизмов.

Осморегуляция - поддержание клетками оптимального для данного микроорганизма осмотического давления. Функцию осморегуляции осуществляет механизм активного транспорта веществ. Изменение привычной концентрации среды может привести к нарушению обмена веществ в клетках микроорганизмов, а иногда может вызвать их гибель.

При попадании микроорганизма в субстрат с ничтожно малой концентрацией растворенных веществ (например, в дистиллированную воду) в клетках наблюдается плазмоптис (чрезмерное насыщение цитоплазмы водой),

76

что может привести к разрыву цитоплазматической мембраны и гибели микроорганизма.

При попадании микроорганизма в субстрат с концентрацией веществ выше оптимальных значений наступает плазмолиз - обезвоживание цитоплазмы. При этом клетки впадают в состояние анабиоза.

Микроорганизмы, способные существовать в субстратах с высоким осмотическим давлением называются осмофилами.

Галофилы - микроорганизмы, способные расти на средах с высоким содержанием поваренной соли. Умеренные галофилы развиваются при концентрации соли 1-2%, хорошо растут при 10% соли и могут выносить содержание соли 20%. Крайние галофилы не развиваются при содержании соли ниже15% и могут хорошо расти при концентрации соли в среде 30% (насыщенный раствор).

Неспособность большинства микроорганизмов расти на средах с высокими концентрациями соли и сахара используют в пищевой промышленности для консервирования различных продуктов. В отличие от поваренной соли, растворы сахара являются хорошей питательной средой и гибель микроорганизмов наступает лишь при концентрации сахара в растворе 65-70%.

ЛЕКЦИЯ 12. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

План:

1.Питание микроорганизмов

2.Ферментные системы микроорганизмов

3.Классификация бактерий по типу питания.

4.Механизмы питания бактерий

5.Классификация микроорганизмов в зависимости от источника энергии

1. Питание микроорганизмов

Все физиологические процессы, такие как движение, рост и размножение, образование спор и капсул, выработка токсинов, могут осуществляться только при постоянном притоке энергии. В процессе питания организм получает вещества, необходимые для синтеза клеточных структур и являющиеся источником энергии для всех процессов жизнедеятельности. Характерными особенностями питания микробов являются поступление питательных веществ внутрь клетки через всю ее поверхность и высокая скорость процесса обмена веществ.

Клеточная стенка и ЦПМ микроорганизмов непроницаемы для многих высокомолекулярных веществ (полисахаридов, липидов, белков и др.), в связи с чем эти вещества вначале расщепляются экзоферментами, выделяемыми клетками во внешнюю среду, на более простые соединения (моно- и дисахариды, аминокислоты, органические кислоты, глицерин и т. д.). Такой процесс, свойственный только микроорганизмам, называется внешним перевариванием.

77

2. Ферментные системы микроорганизмов

В основе метаболических реакций, протекающих в клетке, лежит деятельность ферментов – самого крупного и высокоспециализированного класса белков. Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты, которые относятся к шести известным классам: оксидоредуктазы,

трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Их значение в жизнедеятельности клетки:

Гидролазы – гидролитический катализ белков, жиров и углеводов.

Оксидоредуктазы – участие в окислительно-восстановительных процессах.

Трансферазы – перенос определенных радикалов.

Лиазы – участие в соединении двух молекул.

Изомеразы – участие в изомеризации органических соединений.

Лигазы – участие в реакциях присоединения и отрыва групп. Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и

является достаточно постоянным признаком. Многие ферменты связаны со структурными компонентами микробной клетки и определяют интенсивность процессов биосинтеза, идущего в них. Так, например, в ЦПМ находятся окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании. В клеточной стенке идет синтез ферментов, связанных с делением клетки и ее аутолизом. Основная часть ферментов локализована в цитоплазме. Ферменты продуцируются самой микробной клеткой и по месту, выполняемой им функции разделяются на экзоферменты и эндоферменты.

Экзоферменты — ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (протеазы, полисахаридазы, олигосахаридазы). Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например, гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Эндоферменты — ферменты бактерий, действующие на субстраты внутри клетки (расщепляющие аминокислоты, моносахара и др.).

78

3. Классификация бактерий по типу питания.

По химическому составу и характеру биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) прокариотические клетки не отличаются от эукариотических. Бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, т. е. являются голофитными.

Основными химическими компонентами бактериальной клетки являются органогены — углерод, азот, водород, кислород.

Источники углеродов: в настоящее время все бактерии, в зависимости от способности усваивать различные формы углеродосодержащих соединений, подразделяются по типу питания на две группы:

Автотрофы (autos - сам, trophe - питание) способны строить сложные соединения углерода из С02 и Н20. К ним относятся нитрифицирующие бактерии, железобактерии и др.Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли.

Гетеротрофы (heteros - другой) нуждаются в готовых органических соединениях. Они подразделяются на сапрофиты (sapros - гнилой, phyton - растение) и паразиты (parasitos - нахлебник). Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления восстановленных углеродных (органических) соединений. Некоторые из них, такие какE.coli, способны к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Другие, например, молочнокислые бактерии, - растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называютсяфакторами роста.

Сапрофиты используют готовые органические соединения, но они независимы от других организмов. К ним относят микробов, вызывающих процессы гниения и брожения.

Паразиты - это микробы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизма. Различают облигатные паразиты и факультативные. Облигатные паразиты способны размножаться только в живой клетке, они не растут на питательньгх средах. К ним относятся риккетсии, хламидии и вирусы.

Источники азота. Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, витаминов) микробам нужен азот. Одни способны усваивать молекулярный азот из воздуха или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов, другие используют органические азотсодержащие соединения.

1.азотфиксирующие микроорганизмы — способны усваивать моле-

кулярный азот атмосферы;

2.микроорганизмы, ассимилирующие неорганический азот из солей аммония — аммонифицирующие;

3.микроорганизмы, ассимилирующие неорганический азот из нитратов

—нитратредуцирующие;

4.микроорганизмы, ассимилирующие неорганический азот из нитритов

—нитритредуцирующие.

79

Однако большинство патогенных для человека микроорганизмов способны ассимилировать только азот органических соединений. Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония (углеводы, аминокислоты и др.) и не нуждающиеся в факторах роста называются прототрофами.

Микроорганизмы, неспособные синтезировать какое-либо из необходимых соединений и ассимилирующие их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного),

называются ауксотрофами по этому соединению. Это микроорганизмы,

которые нуждаются в готовых факторах роста (аминокислотах, витаминах, пуриновых и пиримидиновых основаниях). Чаще всего ими являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме углерода, азота, водорода и кислорода, для биосинтетических реакций микробам необходимы соединения, содержащие серу (она обеспечивает образование и сохранность третичной и четвертичной структуры белковых молекул, входит в состав коэнзимов), фосфор (фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, АТФ, флавинов), минеральные соли (К, Mg, Са, Сu, Мо, необходимые для действия ферментов), факторы роста.

Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода - до 0,1 мг/л в день, они получили название олиготрорфных, противоположную группу для них составляют бактерии копнотрофные, способные к росту на богатых пищевых субстратах.

4. Механизмы питания бактерий

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный.

Таблица 3. - Виды транспорта в бактериальной клетке

80

* концентрация неизмененного питательного вещества внутри клетки может быть одинаковой с его внеклеточным содержанием, но концентрация химически измененного питательного соединения внутри клетки может значительно превышать концентрацию неизмененного соединения в среде.

При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного переноса: простую диффузию и облегченную диффузию (табл. 3).

Простая диффузия — неспецифическое проникновение по градиенту концентрации веществ в клетку. Осуществляется до тех пор, пока концентрация вещества не будет равной по обе стороны мембраны (внутри и вне клетки). Скорость переносанезначительна, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности. Только мелкие гидрофобные молекулы способны проходить через гидрофобный билипидный слой мембраны, так в клетку поступает вода и растворенные в ней низкомолекулярные вещества.

Облегченная диффузия протекает по градиенту концентрации при обязательном участии специфических белков – пермеаз, локализованных в мембране, энергонезатратная. На внешней стороне мембраны они распознают и связывают молекулу субстрата и обеспечивают ее перенос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза-субстрат диссоциирует, и молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки. Скорость этого способа переноса зависит от концентрации вещества в наружном слое.

При активном переносе вещество проникает в клетку против градиента концентрации при помощи белка-переносчика — пермеазы. При этом происходит затрата энергии, так как этот процесс происходит тогда, концентрация вещества в микробной клетке выше чем в питательной среде. Имеется два типа активного транспорта.

Активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен, энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде. Транспортируемое вещество взаимодействует со специфическим связывающим белком (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), локализованном в периплазматическом пространстве, затем связывающий белок взаимодействует с транспортным белком, находящимся в цитоплазматической мембране, который осуществляет транспорт молекулы внутрь клетки. При этом типе активного транспорта небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) «накачиваются» в клетку и создают концентрацию, которая может в 100-1000 раз превышать концентрацию этого вещества снаружи клетки.

Транслокация радикалов (перенос групп) - против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, составной частью которой является белок-переносчик, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде. Этот механизм обеспечивает включение в клетку некоторых сахаров (например, глюкозы, фруктозы), которые в процессе переноса фосфорилируются, т.е. химически модифицируются. Фосфорилированный