mikrobiologiia

241

Лабораторная работа №2

Тема: Поверхностные структуры бактериальной клетки. Цитоплазматическая мембрана.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИЙ И ОКРАСКА ИХ ПРОСТЫМИ И СЛОЖНЫМИ МЕТОДАМИ.

(2 часа)

Цель работы: Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации.

Задачи:

1.Ознакомиться с морфологическими признаками бактерий.

2.Освоить технику приготовления фиксированных препаратов бактерий и окраски препаратов бактерий простыми методами.

3.Освоить технику окраски бактерий по методу Грама.

Оборудование, материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла; спиртовка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму (фильтровальные бумажки с генцианвиолетом, растворы Люголя и фуксина рабочего) и для окраски по предложенным методам; 96 %-ный этиловый спирт: лоток с рельсами для предметных стекол; промывалка; чистые культуры бактерий.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Ознакомиться с морфологическими признаками бактерий.

Морфологические признаки бактерий

Большинство бактерий являются одноклеточными, разнообразными по форме, размерам и обмену веществ. При дифференциации бактерий путем микроскопии учитывают размеры и формы клеток, их взаимное расположение, химический состав и строение клеточных стенок, способность образовывать споры и капсулы, подвижность.

Основные формы бактериальных клеток — шаровидная, палочковидная и извитая (рисунок 4).

Форма клеток большинства бактерий является устойчивым видовым признаком. Размеры бактериальных клеток невелики. Длина большинства палочковидных бактерий, вибрионов и спирилл составляет 0,5-3 мкм, толщина

— 0,5-1 мкм. Диаметр шаровидных бактерий обычно не превышает 2 мкм. Длина клеток некоторых видов спирохет достигает 500 мкм (0,5 мм).

Шаровидные бактерии могут делиться одной, двух или трех плоскостях (рисунок 3).

242

Рис.3 – Взаимные расположения кокков:

а– микрококки; б – диплококки; в – стрептококки; г – тетракокки; д – стафилококки;

е- сарцины

Рис.4 – Основные формы бактерий

Микрококки, встречающиеся в природе в виде одиночных шаровидных клеток; к ним относят Micrococcus agilis (от лат. micro - маленький, agilis - подвижный); нередко клетки после деления не расходятся, а остаются соединенными между собой, образуя различные сочетания.

Диплококки (от лат. diploos - двойной) - шаровидные бактерии, соединенные по две клетки; к ним относят Azotobacter chroococcum; родовое название вида отражает способность этих бактерий фиксировать азот атмосферы, видовое - продуцировать коричневый пигмент (лат. Chroo - коричневеющий).

Стрептококки (от лат. streptos - цепь) - шаровидные клетки, образующие в результате деления в одной плоскости разнообразной длины цепочки; с этими бактериями знакомятся при изучении молочнокислого брожения на примере Streptococcus lactis; родовое название отражает характер расположения

243

шаровидных клеток в виде цепочки, видовое - причастность стрептококка к молочнокислому брожению (от лат. lactis - молочный).

Сарцины (от лат. sarceo - соединяю) ~ шаровидные бактерии, группирующиеся по восемь клеток; располагаются в виде куба (с каждой стороны по четыре клетки); такая форма возникает в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, отдельные виды сарцин формируют большие сарционоподобные кубообразные пакеты, но уже с каждой стороны находится не по четыре клетки (субъединицы сарцины), а по четыре сарцины; удобна для просмотра Sarcina flava (сарцина желтая) - наиболее обычный представитель микрофлоры воздуха.

Особую группу образуют нитчатые бактерии, состоящие, как правило, из одного ряда клеток, которые соединены в длинные нити (трихомы), нередко одетые общим слизистым чехлом.

Основными морфологическими признаками палочковидных бактерий, которые определяются путем микроскопии, являются размеры палочек (средняя длина палочек – 2…7 мкм, диаметр в поперечнике - 0,5…1 мкм), взаимное расположение клеток, способность образовывать споры, подвижность. Палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке, попарно (диплобактерии) и цепочками (стрептобактерии). На рисунке 5 представлены морфологические разновидности палочковидных бактерий.

Рис.5 – Морфология палочковидных бактерий:

а - диплобактерии; б - стрептобактерии; в - бациллы; г – клостридии

При микроскопии легко можно определить спорообразующие и не спорообразующие формы палочковидных бактерий. Вегетативные клетки хорошо адсорбируют красители на своей поверхности и полностью окрашиваются. Оболочка споры малопроницаема, краски в них почти не проникают и под микроскопом споры имеют вид округлых или овальных блестящих зерен. Палочки, образующие споры называются бациллами и клостридиями. У бацилл размер споры не превышает ширину клетки и поэтому при образовании споры форма клетки не меняется.

У клостридий диаметр споры больше толщины клетки и поэтому при созревании споры клетка приобретает форму веретена (если спора располагается в центре клетки) или барабанной палочки (если спора располагается на одном из полюсов клетки). При идентификации палочек диагностическое значение имеют также расположение спор в клетках бацилл и клостридий, наличие и расположение жгутиков, способность образовывать капсулы.

244

ЗАДАНИЕ 2. Освоить технику фиксации мазка.

Приготовление фиксированных препаратов:

На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной петлей наносят небольшую каплю воды. В нее вносят исследуемый материал, отобранный по методике, описанной выше.

1.Полученную суспензию равномерно распределяют по поверхности

стекла тонким слоем таким образом, чтобы препарат распределился на площади примерно 2…3 см2 .

2.Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе.

3.Производят фиксацию мазка. Для этого стекло с высохшим мазком проводят 3-4 раза над пламенем горелки той стороной, где мазок отсутствует.

Цель фиксации:

- умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);

- зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);

- улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители.

Приготовление фиксированных препаратов из естественных мест обитания микроорганизмов проводится так же, как и из чистых культур.

Помимо термической обработки, применяют также фиксацию химическими веществами: погружают предметное стекло с мазком в мензурку с 96 %-ным этанолом на 15-20 мин, с ацетоном на 5 мин, со смесью 96 % -ного этанола и 40%- ного формалина (соотношение 95:5) на 2 мин. и др.

ЗАДАНИЕ 3. Изучить принцип и диагностическое значение простых методов окраски бактерий.

Фиксированные препараты нельзя рассмотреть под микроскопом, так как они являются бесцветными и пропускают световые лучи. Поэтому их окрашивают, используя простые или сложные методы. При окрашивании фиксированных мазков простыми методами используют один краситель (фуксин, краска Муромцева, генцианвиолет, метиленовая синь и др.).

Последовательность окрашивания мазка простыми методами:

1.На фиксированный препарат наносят несколько капель красителя таким образом, чтобы он покрывал всю поверхность мазка и выдерживают в течение определенного времени. Так, при окраске фуксином на мазок наносят несколько капель красителя и выдерживают его на мазке 2…3 мин. При окрашивании препарата из кефира на него краску Муромцева наносят на мазок через полоску фильтровальной бумаги на 3…5 мин.

2.Краску смывают с мазка слабой струей до бесцветной смывной воды. При этом стекло держат в наклонном положении над лотком.

3.Мазок подсушивают фильтровальной бумагой, которую осторожно прикладывают к стеклу, и досушивают на воздухе.

245

4. На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100.

ЗАДАНИЕ 4. Освоить технику окраски бактерий по методу Грама.

1.На фиксированный (термически) мазок наливают достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep, метилвиолета) на 1—2 минуты.

2.Затем краску сливают, наливают на мазок раствор Люголя на 1—2 минуты, до почернения препарата.

3.Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30— 60 секунд.

4.Промывают водой.

5.Окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2—3 минут.

6.Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

ЗАДАНИЕ 5. Оформить и проанализировать результаты исследований:

─кратко законспектировать теоретический материал, сущность и технику краски бактерий;

─зарисовать микроскопические картины исследованных чистых культур бактерий с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма;

─под каждым рисунком подписать латинское название микроорганизма, отношение его к окраске по Граму, увеличение исследованного объекта.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Назовите основные признаки, используемые при идентификации микроорганизмов.

2.Назовите морфологические признаки бактерий (кокков, палочек и др.).

3.В чем принцип и диагностическое значение простых и сложных методов окраски бактерий.

4.В чем заключается техника фиксации мазка и его значение?

5.В чем заключается сущность метода окраски бактерий по Граму?

6.Основные этапы техники окраски бактерий по методу Грама.

7.Какие бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным? Отличие строения клеточной стенки их.

246

Лабораторная работа №3

Тема: Цитоплазма и ядерный аппарат бактерий. Покоящиеся формы бактерий. Типы размножения бактерий.

СЛОЖНЫЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ (2 часа)

Цель работы: Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации.

Задачи:

1.Изучить различные сложные и дифференциальные методы окраски бактерий и их структур.

2.Изучить принцип и диагностическое значение сложных и дифференциальных методов окраски бактерий.

3.Освоить технику окраски бактерий предложенными методами. Оборудование, материалы: Микроскоп; водяная баня, лоток с рельсами

для предметных стекол, промывалка, бактериологические петли, предметные стекла; спиртовка, иммерсионное масло; фильтровальная бумага, набор красок фуксин Пфейффера, основной раствор генцианвиолета, тушь, основной фуксин, 20% водного раствора медного купороса, 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4*5H2O), смесь Никифорова, карболовый фуксин Циля, метиленовый синий спиртовой, смесь спирта (80 частей) с формалином (20 частей), метиленовый синий по Леффлеру, 5% раствор азотнокислого серебра или в 0,25% водный раствор протаргола, карболовый раствор фуксина, разведенный в 20 раз, 2% водный раствор метилвиолета (или генцианвиолета), 2% водный раство уксусной кислоты, 1%-й водный р-р H2S04, 5%-й водный раствор H2S04, солянокислый алкоголь (соляной кислоты 3 мл + 96° спирта 97 мл), танин, фенол кристаллический, серебро азотнокислое, раствор Люголя, 96 %-ный этиловый спирт, вода дистиллированная, водопроводная стерильная вода, жидкость Руге (формальдегид 40%—2 мл, ледяной уксусной кислоты — 1 мл, дистиллированной воды—100,0), 2%-го раствор осмиевой кислоты, 1н.НСl, 1%-й раствор формалина, 0,1-1,0%-й водный раствор основного фуксина, Судан III или Судан черный, метиленовый синий в воде (1:40), 0,1% KМnO4 в 0,3н НNО3 или 0,3н НСl, % водный раствор хромовой кислоты, 0,5% водный раствор нейтральрота, 1—2% водный раствор соляной кислоты, 1% водный раствор малахитовой зелени, 0,5% раствор хлористоводородной кислоты. Чистые культуры бактерий, накопительная культура маслянокислых бактерий.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Приготовить фиксированные мазки и окрасить их предложенными методами на выявление:

1. капсул;

247

2.клеточной стенки;

3.кислотоустойчивости;

4.жгутиков;

5.нуклеоида;

6.гранул углеводной природы (полисахаридов);

7.гранул липидных;

8.полифосфатов (волютина и метахроматина);

9.эндоспор.

ЗАДАНИЕ 2. Оформить и проанализировать результаты исследований:

─кратко законспектировать теоретический материал, сущность и технику окраски бактерий различными методами окрашивания;

─зарисовать микроскопические картины исследованных чистых культур бактерий с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма;

─под каждым рисунком подписать латинское название микроорганизма, отношение его к окраске, увеличение исследованного объекта.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Какие признаки учитывают при идентификации микроорганизмов. Какие признаки являются основными при дифференциации бактерий?

2.Как провести дифференциацию кокковых форм бактерий по их взаимному расположению?

3.Каким образом можно провести дифференциацию палочковидных бактерий по их внешнему виду?

4.Каково назначение сложных методов окраски бактерий? Какие сложные методы окраски бактерий Вам известны?

5.Для чего используются дифференциальные (специальные) методы окраски бактерий? Привести примеры.

6.В чем заключается сущность метода окрашивания бактериальных спор?

7.Какова техника окраски спор бактерий?

8.Какими методами можно выявить капсулы у бактерий? Как осуществляют окраску капсул?

Лабораторная работа №4

Тема: Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ПОСУДЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (2 часа)

Цель работы: Изучить состав, способы приготовления питательных сред и методы их стерилизации.

Задачи:

248

1.Изучить различные классификации и химическим состав питательных сред и цель их использования.

2.Ознакомиться с требованиями, предъявляемыми к питательным средам.

3.Освоить правила приготовления питательных сред.

4.Ознакомиться с различными способами стерилизации питательных сред. Оборудование, материалы: Паровой стерилизатор; сушильный шкаф;

посуда: чашки Петри; градуированные пипетки на 1 мл, пробирки, плоскодонные конические или круглодонные колбы разного объема; штатив для пробирок; ватно-марлевые пробки; пергаментная бумага; ножницы; вата, нитки, марля, агар-агар; сухие питательные среды: среда Сабуро, мясопептонный агар (МПА), среды Кесслера, Эндо и др.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Изучить различные классификации и химический состав питательных сред, цель их использования. Изучить правила приготовления питательных сред. Ознакомиться с требованиями, предъявляемыми к питательным средам.

Разнообразные питательные вещества, в которых нуждаются микроорганизмы и которые используются ими для синтеза основных компонентов клетки, роста, размножения и для получения энергии называются питательными веществами, а среда, содержащая питательные вещества, является питательной средой.

По типу питания микроорганизмы, которые встречаются в пищевых продуктах, относятся к хемоорганогетеротрофам. Это значит, что органические вещества, содержащиеся в питательной среде, являются источником углерода, энергии и электронов. Потребности микроорганизмов в тех или иных органических веществах зависят от их видовой принадлежности, и, следовательно, от наличия в клетках и активности соответствующих ферментных систем.

Вкачестве источника углерода микроорганизмы используют углеводы, органические и аминокислоты, спирты, липиды и т.д. Как правило, лучше усваиваются низкомолекулярные органические соединения. Высокомолекулярные органические вещества могут быть использованы для питания только теми микроорганизмами, которые способны синтезировать соответствующие гидролитические экзоферменты. Органические вещества и вода являются также основными источниками водорода и кислорода.

Источником азота для хемоорганогетеротрофов могут быть различные органические и минеральные соединения: белковые вещества, пептоны, аминокислоты, соли аммония, нитраты.

Всреде обязательно должны присутствовать макроэлементы (Р, S, Ca, Mg, K, Fe, Na, Cl), которые вносятся в питательную среду в виде катионов питательных солей.

249

Микроэлементы чаще всего нет необходимости специально вносить в среду, так как большинство микроэлементов является примесью солей макроэлементов или попадают в среду с частицами пыли, из стеклянной посуды или в составе водопроводной воды.

Для многих микроорганизмов нужны в малых дозах факторы роста. Факторы роста обязательно вносят в среды для культивирования ауксотрофных микроорганизмов (микроорганизмов, которые не способны синтезировать сами те или иные органические вещества, которые необходимы для роста и развития), а также добавляют в питательные среды в малых количествах для ускорения роста микроорганизмов, способных эти вещества синтезировать самостоятельно. К факторам роста относятся отдельные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, жирные кислоты, витамины и др., а также природные субстраты, содержащие эти соединения (морковный сок, кукурузный экстракт, автолизат дрожжей, гидролизаты растительного сырья и т.д.).

Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологии. Правильный подбор питательной среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест обитания, получения накопительных и чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность для количественного учета микроорганизмов в различных объектах (в пищевых продуктах, в воздухе, в воде, почве). С помощью питательных сред получают также биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов и биологически активные целевые продукты.

Требования, предъявляемые к питательным средам

1.В среде должны быть все необходимые для роста и развития химические элементы.

2.Среда должна быть сбалансирована по химическому составу. Это значит, что соотношение химических элементов питательной среды и главным образом соотношение органогенных элементов – С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке.

3.Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %.

4.Среда должна иметь определенное значение рН среды. Среди микроорганизмов различают ацидофилы (кислотолюбивые микроорганизмы), алкалофилы (щелочелюбивые микроорганизмы) и нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около 7,0). К ацидофилам относятся грибы и дрожжи. Большинство бактерий – нейтрофилы, для которых активная кислотность среды около 4 ед. рН является губительной. Следует помнить, что при стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов, кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание изменения рН в среду добавляют буферные системы (например, фосфатный буфер), СаСО3 (для

250

нейтрализации образующихся в результате культивирования органических кислот), вещества органической природы, обладающие буферными свойствами (например, аминокислоты, полипептиды, белки) и др.

5.Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки.

6.Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом (rh2), определяющим насыщение ее кислородом. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh2=41, насыщенный водородом rh2=0. Облигатные анаэробы размножаются при rh2 не выше 5, аэробы – не ниже 10.

7.Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост чистых культур микроорганизмов.

Классификация питательных сред

В зависимости от происхождения питательные среды подразделяют на естественные, искуственные и синтетические.

Естественными средами обычно называют такие, которые представляют собой натуральный продукт (молоко, яйца, овощи) или естественный субстрат (вода, свернутая сыворотка крови, растение и т.д.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров растительного, или животного происхождения с добавлением в них неорганических солей, углеводов, азотистых соединений.

Естественные и искусственные питательные среды не имеют постоянного состава, на них развиваются многие микроорганизмы, и они мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов. Используются в основном для выделения и поддержания культур микроорганизмов, их диагностики.

Синтетические среды готовят по определенным рецептам и только на дистиллированной воде с добавлением химически чистых веществ (соль, углевод, аминокислота, витамин и др.) в определенных количествах. Синтетические среды значительно беднее по питательной ценности искусственных и естественных и часто являются элективными (избирательными) средами для определенных групп микроорганизмов.

По консистенции различают питательные среды жидкие, полужидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды состоят из воды и растворенных в ней веществ (мясная вода, мясо-пептонный бульон, среда Виноградского для нитрификаторов). Их применяют для получения биомассы микроорганизмов, их метаболитов, для изучения физиологии и биохимии микроорганизмов, для длительного поддержания коллекции микроорганизмов.

Плотные искусственные среды готовят путем добавления к жидкой среде уплотняющих веществ: желатины (белок, получаемый путем вываривания костей, хрящей и сухожилий животных или чешуи рыб) 10-15% или агар-агара 1-2% (полисахарид, пектинообразное вещество, получаемое из морских водорослей). Плотной основой могут служить также пластинки силикагеля, пропитанные питательной средой.