mikrobiologiia

111

строительные блоки – ауксотрофы. Соединения, по которым микроорганизмы ауксотрофные, – факторы роста – должны присутствовать в среде обитания. Облигатные паразиты могут обладать неполным биосинтетическим потенциалом. В то же время прокариоты-симбионты часто обеспечивают организм-хозяин незаменимыми аминокислотами или витаминами.

К основным метаболитам-предшественникам относятся ацетил-СоА,

пируват, оксалоацетат (ЩУК), фосфоенолпируват (ФЕП), 2-оксоглутарат, гексозофосфаты, пентозофосфаты и др. Это промежуточные продукты,

образующиеся в трех важнейших путях обмена: гликолизе, цикле Кребса, и пентозофосфатном цикле.

2. Ассимиляция углекислоты гетеротрофами и автотрофами.

Углекислота у прокариотов активно используется по путям как конструктивного, так и энергетического метаболизма. В конструктивном метаболизме она выполняет две основные функции: присоединение углекислоты в качестве C1-группы к молекуле клеточного метаболита приводит к удлинению ее углеродного скелета; кроме того, при этом происходит регулирование общего уровня окисленности-восстановленности клеточных метаболитов, поскольку включение CO2-группы в молекулу приводит к заметному повышению степени ее окисленности. Основным путем включения CO2 в вещества клетки у хемогетеротрофных прокариотов служат реакции карбоксилирования:

ПВК + CO2 + АТФ → ЩУК + АДФ +ФН (1)

ФЕП + CO2 → ЩУК + ФН (2)

ПВК + CO2 + НАДФ-H2 → малат + НАД(Ф) + (3) сукцинил-КоА + CO2 + Фдвосст → →α-кетоглутарат + Фдок + KoA-SH (4) α-кетоглутарат + CO2 + НАД(Ф)-H2 → → изоцитрат + НАД(Ф) + (5)

В реакциях участвуют ферменты: пируваткарбоксилаза (1), ФЕП карбоксилаза (2), малатдегидрогеназа (3), α-кетоглутаратсинтаза (4), изоцитратдегидрогеназа (5).

Автотрофы обладают высоко развитой биосинтетической способностью независимо от того, используют ли они в качестве источника энергии окисление минеральных соединений (хемосинтетики) или энергию света (фотосинтетики). Из одного углеродсодержащего соединения CO2 они строят все клеточные метаболиты. Основные биосинтетические процессы осуществляются у них в циклических системах реакций.

Цикл Кальвина, или восстановительный пентозофосфатный цикл.

Он является основным путем фиксации CO2 у всех высших фотосинтезирующих организмов, функционирует в группе пурпурных бактерий, цианобактерий и прохлорофит. Последовательность ферментативных реакций, приводящих к фиксации углекислоты и образованию из нее молекулы гексозы, была расшифрована М. Кальвином с сотрудниками в 50-х гг. В этом цикле впервые акцептором CO2 выступает вещество углеводной природы –

112

Специфическими ферментами цикла Кальвина являются: – фосфорибулокиназа и – рибулозодифосфаткарбоксилаза. Эти ферменты синтезируются только микроорганизмами, обладающими способностью усваивать CO2 в реакциях цикла Кальвина. Первый из них связан с активированием молекулы акцептора путем фосфорилирования, а второй катализирует реакцию акцептирования рибулозо-1,5-дифосфатом молекулы CO2 и последующее гидролитическое расщепление образовавшейся гексозы на 2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК), одна из которых в карбоксильной группе содержит углерод из CO2. Цикл Кальвина – сложный путь, включающий некоторые реакции гликолиза и пентозофосфатного пути. Его можно условно разделить на три этапа:

-фиксация СО2,

-восстановление фиксированного СО2 и

-регенерация акцептора СО2 .

1). Фиксация СО2 происходит в результате одной реакции, катализируемой ключевым ферментом рибулозодифосфаткарбоксилазой, при этом образуются две молекулы 3-ФГК.

2). Образовавшиеся молекулы 3-ФГК затем подвергаются серии последовательных ферментативных превращений, которые включают реакции, известные в гликолитическом пути, но идущие в обратном направлении (6, 7):

3-ФГК + АТФ → 1,3-ФГК + АДФ (6) 1,3-ФГК + НАД(Ф)-Н2 → 3-ФГА + НАД(Ф) + ФН (7)

Реакция восстановления 1,3-ФГК до 3-ФГА (6), катализируемая 3- ФГАдегидрогеназой, у пурпурных и зеленых бактерий зависит от НАД-H2, а у цианобактерий и высших растений – от НАДФ-H2.

3). 3-ФГА превращается во фруктозо-1,6-дифосфат под действием двух ферментов гликолиза. Однако чтобы функционировал этот механизм, необходимо постоянное воспроизведение молекул-акцепторов CO2. Остальные ферментативные реакции цикла служат для регенерации рибулозо-1,5- дифосфата и катализируются ферментами, большинство из которых функционирует в окислительном пентозофосфатном пути (7):

Фруктозо-6-фосфат + 2 ФГА + диоксиацетонфосфат → → 2 ксилулозо-5- фосфат + рибозо-5-фосфат (7).

Затем пентозофосфаты превращаются в рибулозо-5-фосфат, который фосфорилируется вторым ключевым ферментом цикла Кальвина фосфорибулокиназой, и таким образом регенерируется акцептор СО2. Суммарное уравнение восстановительного пентозофосфатного цикла можно изобразить следующим образом (8):

6СО2 + 18АТФ + 12НАД(Ф)-Н2 → → С6Н12О6 + 18Фн + 18АДФ + 12НАД(Ф) (8)

113

Для синтеза 1 молекулы глюкозы из CO2 необходимо 6 оборотов цикла. Восстановительный пентозофосфатный цикл является основным

механизмом автотрофной ассимиляции углекислоты. У большинства фотосинтезирующих бактерий он функционирует с помощью фотохимически образованными АТФ и восстановителями. У большой группы хемоавтотрофных бактерий этот путь фиксации CO2 сочетается с темновыми окислительными процессами получения энергии.

Цикл Арнона, или восстановительный цикл трикарбоновых кислот.

Был обнаружен у зеленых серобактерий. В его основе лежат реакции восстановительного карбоксилирования органических кислот. В этом цикле углекислота фиксируется в четырех ферментативных реакциях, две из которых идут при участии фотохимически восстановленного ферредоксина, а одна – таким же путем образованного НАД-H2. В результате одного оборота цикла из 4 молекул CO2, 10 [Н] с использованием энергии (3 молекулы АТФ) синтезируется молекула ЩУК – конечный продукт цикла. Все реакции, в которых происходит фиксация CO2 в цикле, функционируют как механизмы хемогетеротрофной фиксации CO2 или аналогичны им.

Таким образом, реакции фиксации CO2 принципиально не новы, они заимствованы из гетеротрофного метаболизма. Шагом вперед можно считать создание определенной последовательности ферментативных реакций, замыкающихся в цикл.

Глюконеогенез.

Если прокариоты выращивать на средах, где источник углерода – одно-, двухили трехуглеродные соединения, то необходимые сахара они должны синтезировать из имеющихся в среде источников углерода.

Ключевым интермедиатом в процессе биосинтеза различных углеводов является глюкозо-1-фосфат. Он образуется из ФЕП, т.е. из неуглеводного источника. Вот почему образование C6-углеводов из неуглеводных предшественников получило название глюконеогенеза. Таким путем могут синтезироваться свободная глюкоза, другие моносахариды, дисахариды, полисахариды и др. Глюкоза при необходимости может трансформироваться в другие моносахариды: галактозу, маннозу, фруктозу, глюкуроновую кислоту, при участии соответствующих ферментов. Глюконеогенез характерен для гетеротрофных микроорганизмов. Предшественниками могут быть промежуточные продукты цикла Кребса, ацетил-КоА, аминокислоты.

Из синтезированных или поступающих в готовом виде из питательной среды сахаров микроорганизмы могут синтезировать полисахариды. В результате процессов полимеризации и конденсации образуются такие полимеры, как клетчатка, крахмал, хитин, целлюлоза и др. Эти процессы требуют затраты большого количества энергии. Характерной особенностью синтеза полисахаридов является необходимость затравки. Это короткий сегмент того же полисахарида, который будет синтезироваться; он служит акцептором новых мономерных фрагментов.

3. Усвоение минеральных соединений азота

114

3.1. Фиксация азота.

Микроорганизмы способны фиксировать свободный азот из воздуха. Прежде чем такой окисленный элемент станет составной частью аминокислот он должен быть восстановлен. Основными компонентами системы фиксации азота являются сильные восстановители: АТФ, ферредоксин или флаводоксин и нитрогеназный комплекс. Нитрогеназа – двухкомпонентный ферментный комплекс, каждый компонент которого неактивен в отдельности. Молекулярные массы компонентов различны: у большого компонента – 150...270 кДа, малого – 50...70 кДа. Большой компонент – железо-молибден- протеин (молибдоферредоксин), малый – железо-протеин (азоферредоксин). Восстановление N2 до NН3 с участием нитрогеназы происходит по следующей

суммарной реакции (9):

N2 + 6Fe2+ + 6H+ + 12АТФ → → 2NH3 + 6Fe3+ + 12АДФ + 12Фн (9)

Кислород репрессирует синтез нитрогеназы. Ее активность проявляется при низкой концентрации кислорода в газовой среде. Даже аэробные азотфиксаторы осуществляют процесс фиксации азота в микроаэробных условиях. Так, свободноживущий азотфиксатор Azotobacter образует слизь, препятствующую диффузии кислорода в клетки. К тому же азотобактер часто находится в ассоциации с не азотфиксирующими аэробами. Клубеньки, где происходит фиксация азота бактериями рода Rhizobium, ограничивают доступ молекулярного кислорода. Эту же функцию выполняет леггемоглобин, активно связывающий кислород и контролирующий его поступление в бактероиды. У цианобактерий стенка гетероцисты надежно отделяет фермент от выделяемого ими кислорода в процессе фотосинтеза. Нитрогеназа восстанавливает не только азот, но и неспецифические для нее субстраты: оксиды азота, цианиды, ацетилен и другие соединения с тройной связью.

Образование нитрогеназы связано с наличием в клетках азотфиксирующих микроорганизмов nif-плазмиды, содержащей nif-ген, регулирующий синтез этого белка. Передача nif-плазмиды от одного вида бактерий к другому может привести к появлению азотфиксирующей способности у новых видов микроорганизмов. Способность микроорганизмов фиксировать азот атмосферы и обогащать им почву нашла применение в сельском хозяйстве. На основе использования таких микроорганизмов, как клубеньковые бактерии и азотобактер, получают бактериальные удобрительные препараты нитрагин и азотобактерин.

3.2. Ассимиляционная нитратредукция.

Многие микроорганизмы способны восстанавливать нитраты до аммиака – ассимиляционная нитратредукция. В этом случае нитрат вначале восстанавливается в нитрит с помощью фермента нитратредуктазы. Донором электронов у бактерий выступает НАД-Н2, а у грибов – НАДФ-Н2. Нитратредуктаза (М = 800 кДа) – тетрамер, состоящий из двух димеров, одна субъединица димера имеет молекулярную массу 150 кДа, другая – 50 кДа. Это также молибденсодержащий фермент. Реакция восстановления нитратов в присутствии нитратредуктазы протекает в две стадии (10, 11):

115

НАДФ·Н + Н+ + NO3- → NO2- + НАДФ+ + Н2О (10)

NO2- + 8H + 6e- → NH4- + 2H2O (11)

Аммиак, образующийся различными путями в природе, включается в состав органических соединений, и прежде всего – аминокислот, благодаря трем главным реакциям: аминирования, амидирования и переаминирования.

4. Синтез аминокислот

Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты, входящие в состав клеточных белков, но есть виды, нуждающиеся в большинстве аминокислот. В качестве исходных углеродных скелетов для биосинтеза аминокислот служит небольшое число промежуточных соединений различных метаболических путей. Введение в молекулу некоторых из них аминного азота приводит к образованию аминокислот. Однако в большинстве случаев исходные соединения должны подвергнуться значительным перестройкам, чтобы сформировать углеродный остов молекулы будущей аминокислоты. Аммиак включается в состав аминокислот, благодаря трем главным реакциям: аминирования, амидирования и переаминирования.

Реакции аминирования приводят к образованию из пировиноградной кислоты аланина, а из α-кетоглутаровой – глутаминовой кислоты. Реакции амидирования ведут к образованию глутамина и аспарагина из глутаминовой и аспарагиновой кислот. Глутаминовая кислота и глутамин прямо или косвенно служат донорами амино- и амидогрупп при синтезе практически всех аминокислот и других азотсодержащих органических соединений. Аспарагин используется только для синтеза белковых молекул. Во все остальные аминокислоты азот вводится посредством реакций переаминирования, катализируемых соответствующими аминотрансферазами, во всех реакциях одним из участников является глутаминовая кислота. Еще одним путем включения азота аммиака в состав органических соединений является реакция, катализируемая карбамоилфосфат-синтетазой и приводящая к образованию карбамоилфосфата. Дальнейшее использование азота карбамоилфосфата происходит по двум путям: для синтеза пиримидинов и аргинина. Особенностью биосинтеза аминокислот является использование общих биосинтетических путей. Так, 19 из 20 аминокислот, входящих в состав белков, можно по способу их происхождения разделить на 5 групп. Только одна аминокислота (гистидин) образуется по отдельному биосинтетическому пути. Вновь синтезированные аминокислоты включаются в белки под контролем генетического аппарата клетки.

ЛЕКЦИЯ 19. НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ

План:

1.Изменчивость микроорганизмов, доказательства мутационной природы изменения наследственных признаков у бактерий.

2.Понятие об адаптации микроорганизмов.

3.Мутации у бактерий; мутагенные факторы.

4.Мобильные генетические элементы бактерий

116

1. Изменчивость микроорганизмов, доказательства мутационной природы изменения наследственных признаков у бактерий

Генетика – наука о наследственности и изменчивости живых организмов. В отличие от классической генетики, генетика бактерий – относительно молодая отрасль микробиологии, первые работы по которой появились в начале 1940-х годов. Генетика бактерий пользуется всеми терминами и определениями, разработанными для классической генетики. С момента возникновения и до настоящего времени она завоевала необычайную популярность. Успех популярности генетики бактерий обусловлен двумя

главными причинами:

Во-первых, основные принципы генетики бактерий в равной степени применимы ко всем животным и растительным организмам независимо от того, являются они многоклеточными или одноклеточными. Это связано с тем, что все живые организмы обладают наследственным материалом, заключенным в нуклеиновые кислоты.

Во-вторых, в исследованиях по изучению природы наследственности прокариоты в значительной степени заменили такие излюбленные объекты генетики, как дрозофила, мышь, кукуруза, поскольку бактерии имеют высокую скорость размножения и образуют популяции с высокой плотностью, а процесс их культивирования относительно прост. Это позволяет проводить генетический анализ в короткие сроки с использованием огромного числа особей, которые не занимают значительных площадей. Кроме того, использование клеток бактерий позволяет изучать биологические явления на уровне одной клетки, избегая их сложных взаимодействий и взаимозависимостей, типичных для высших организмов.

Термин «мутация» введен Г. де Фризом (1901), изучавшим изменчивость и наследственность у растений и определившим мутацию как «скачкообразное изменение наследственного признака». Это понятие М. Бейеринк (1912) позднее распространил и на бактерии. Мутация – событие редкое и обычно спонтанно происходит с частотой 1·10–4–1·10–10.

Врезультате постановки ряда экспериментов были получены данные, свидетельствующие о том, что у бактерий мутации носят спонтанный и ненаправленный характер. К их числу относятся, прежде всего, эксперименты С. Лурия, М. Дельбрюка, Г. Ньюкомба и супругов Е. и Дж. Ледерберг.

В1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюк доказали спонтанное возникновение мутантов бактерий с помощью флуктуационного теста. В эксперименте с участием бактериофага Т1, обладающего высокой вирулентностью в отношении бактерий E. coli, исследовался процесс возникновения устойчивости

уданных бактерий к фагу.

При постановке эксперимента культуру бактерий E. coli, полученную из одной клетки (т. е. чистую культуру), чувствительную к бактериофагу Т1, выращивали до определенной плотности и разделяли на две части. Далее одну из них распределяли по 1 мл в 100 пробирок. Вторую часть оставляли в объеме 100 мл. После этого все культуры инкубировали в одинаковых условиях. На

117

следующем этапе выращенные культуры засевали на агаризованную среду с фагом Т1. В результате на поверхности среды формировалось определенное количество колоний, которые можно рассматривать как устойчивые к фагу. Устойчивые к фагу Т1 бактерии сохраняют данное свойство также и при последующем их культивировании в отсутствии фага (рис.35).

Рис. 35. Флуктуационный тест С. Лурия и М. Дельбрюка

Принцип флуктуационного теста заключается в следующем: если устойчивые мутанты возникают при контакте с фагом (изменчивость адаптивная), то каждая культура независимо от того, из какой части она была взята, должна содержать приблизительно одинаковое количество устойчивых клеток. Если же устойчивые бактерии возникли спонтанно, до обработки фагом, то следствием этого является тот факт, что их количество в засеянных независимых культурах (100 пробирок) будет отличаться от количества, полученного при анализе образцов, из одной и той же (100 мл) культуры.

Независимо полученные результаты свидетельствуют о том, что культуры разного происхождения действительно обнаруживают более резкие колебания (флуктуации) в содержании устойчивых клеток (0, 103, 62, 3, 159 и т. п.), чем пробы, взятые из одного и того же образца (142, 140, 155, 146, 110 и т. п.), что подтверждает гипотезу о спонтанном характере возникновения мутаций.

В 1949г. Г.Ньюкомб поставил другой по методическому подходу эксперимент с фагом Т1 и бактериями E. coli, который впоследствии получил название перераспределительного теста. Он засевал чашки Петри культурой E. coli, чувствительной к фагу Т1, с образованием сплошного газона. Засеянные чашки инкубировались при оптимальных условиях (37ºС) в течение 5 ч. За это время каждая из высеянных клеток формировала микроколониию. Затем в половину засеянных чашек Петри вносили по 0,1 мл физиологического

118

раствора и с помощью шпателя перераспределяли клетки на поверхности среды. Остальные чашки оставались нетронутыми (контроль). На поверхность всех чашек с помощью пульверизатора Ньюкомб наносил суспензию фага Т1, и чашки повторно помещал в термостат. После инкубирования определяли число колоний, являющихся потомством устойчивых клеток.

Принцип, положенный в основу данного теста, предполагает, что устойчивые клетки возникают вследствие спонтанных мутаций до контакта с фагом, и на чашках, где бактерии были перераспределены, должно формироваться больше устойчивых колоний, чем на контрольных чашках, так как каждая клетка из микроколонии устойчивых бактерий после перераспределения сформирует колонию, устойчивую к фагу Т1 (рис. 36).

Рис. 36 -Перераспределительный тест Ньюкомба

Именно эти результаты и были получены Г. Ньюкомбом, которые прямо свидетельствуют о том, что фагоустойчивые мутанты возникают до контакта с фагом в результате спонтанных мутаций. Бактериофаг в этом случае выступает лишь в качестве селективного агента, позволяющего выявить небольшое количество фагоустойчивых мутантов, присутствующих в популяции.

Таким образом, результаты флуктуационного и перераспределительного тестов доказывают, что мутации у микроорганизмов возникают ненаправленно до воздействия селектирующего агента (в данном случае фага Т1).

В 1952 г. супруги Е. и Дж. Ледерберг предложили способ непрямого отбора мутантов методом реплик, или отпечатков, и использовали его для доказательства спонтанной природы возникновения мутаций у бактерий. Супруги Ледерберг провели следующий эксперимент. Чистую культуру фагочувствительных бактерий E. coli выращивали в бульоне до концентрации 1·108 кл/мл, после чего ее высевали на поверхность питательной среды в чашке Петри для образования газона сплошного роста. Затем при помощи метода реплик производили пересев бактерий параллельно на две чашки – одну с

119

обычной средой (1); другую – предварительно засеянную фагом (2). Чашки помещали в термостат для инкубирования. На чашке, засеянной фагом, сформировались отдельные колонии фагоустойчивых бактерий. На чашке без фага наблюдался сплошной рост. Чашки 1 и 2 совмещали, и из чашки с обычным питательным агаром (1) производили пересев в бульон участка, соответствующего ареалу фагоустойчивых колоний в чашке с фагом (2). Размножившиеся клетки рассевали на свежей питательной среде в чашках и после инкубации переносили с помощью стерильного бархатного штампа в две чашки (с обычной средой и со средой, засеянной фагом) (рис. 37).

Рис. 37 - Непрямой отбор фагоустойчивых мутантов методом реплик

Такую процедуру повторяли многократно, и в итоге была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом. Этот эксперимент явился еще одним доказательством мутационной природы изменчивости у бактерий.

Мутационная изменчивость относится к генотипической, или наследственной, изменчивости, так как при этом возникающие изменения в молекуле ДНК бактерий передаются по наследству.

Метод реплик (в микробиологии) заключается в том, что с исходной чашки Петри, где на твердой среде растут колонии бактерий, делается отпечаток на ворсистую ткань, а затем с ткани бактерии переносятся на несколько других чашек, где рисунок их расположения оказывается тем же, что на исходной чашке.

Размножившиеся клетки рассевали на свежей питательной среде в чашках и после инкубации переносили с помощью стерильного бархатного штампа в две чашки (с обычной средой и со средой, засеянной фагом) (рис. 37).

120

Такую процедуру повторяли многократно, и в итоге была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом. Этот эксперимент явился еще одним доказательством мутационной природы изменчивости у бактерий.

2. Понятие об адаптации микроорганизмов

Кроме генотипической, существует модификационная изменчивость, которая рассматривается как ответ на изменение условий окружающей среды и наблюдается до тех пор, пока действует фактор, вызывающий эти изменения.

Модификационная изменчивость (ее называют еще фенотипической изменчивостью) проявляется на уровне фенотипа и не затрагивает генотип.

Фенотипическая изменчивость проявляется у подавляющего большинства особей в популяции, в то время как при мутационной изменчивости изменение генотипа происходит только у единичных клеток.

Модификация есть результат пластичности клеточного метаболизма, приводящего к фенотипическому проявлению «молчащих» генов в конкретных условиях. Таким образом, модификационные изменения имеют место в

рамках неизменного клеточного генотипа.

Существует несколько проявлений модификационных изменений.

Наиболее известны адаптивные модификации, т.е. ненаследственные

изменения, полезные для организма и содействующие его выживанию в изменившихся условиях.

Причины адаптивных модификаций кроются в механизмах регуляции действия генов. Их примером может служить адаптация клеток бактерий E. Coli к лактозе как новому субстрату: в этих условиях начинают синтезироваться индуцибельные ферменты, т. е. происходит фенотипическое проявление генов, «молчащих» при отсутствии лактозы в среде.

У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.). В данном случае адаптивная реакция проявляется в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков, которые получили название белки теплового шока, а явление – синдром теплового шока. При стрессовых воздействиях на бактериальную клетку в ней ингибируется синтез обычных белков, но индуцируется синтез небольшой группы белков, функции которых заключаются в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоида и мембран. Считается, что адаптивные модификации расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды. Возникающие модификации могут быть относительно стабильными, они могут сохраняться на протяжении нескольких поколений или, наоборот, очень лабильными.

Тем не менее, не все модификации можно рассматривать как адаптивные. При интенсивном воздействии многих агентов наблюдаются ненаследуемые

изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию.