mikrobiologiia

41

энергизованной мембраны. От активного транспорта зависит сродство клеток к субстрату, т. е. основной признак, определяющий и набор, и концентрацию используемых веществ.

У многих бактерий, особенно грамотрицательных, в активном транспорте принимают участие особые связующие белки, не идентичные пермеазам и не входящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связующих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам и различным аминокислотам, углеводам, неорганическим ионам. Выделено и изучено более 100 различных связующих белков, которые образуют прочные комплексы со своими субстратами и необходимы для их активного переноса через мембрану. Связующие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществляющими активный перенос субстрата через мембрану. Необходимая для этого метаболическая энергия используется для снижения сродства пермеазы к своему субстрату на внутренней стороне мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку.

Если во всех вышеупомянутых способах переноса веществ через цитоплазматическую мембрану они поступают в клетку в химически неизмененном виде, то при транслокации групп происходит химическая модификация переносимых молекул. Так происходит поступление в клетку многих прокариот углеводов, в процессе которого они фосфорилируются. Источником фосфатной группы служит фосфоенолпируват, от которого фосфат с помощью фермента (фермента I), находящегося в цитоплазме, переносится на молекулу специального термостабильного белка, а с него при участии второго фермента (фермента II), локализованного в цитоплазматической мембране и обнаруживающего высокое сродство к определенным углеводам, фосфатная группа переносится на углевод на наружной стороне цитоплазматической мембраны:

фермент I

Фосфоенолпируват + белок ► пируват + белок-Ф,

фермент II

Белок-Ф + углевод ► углевод-Ф + белок.

Фосфорилированные углеводы проникают через цитоплазматическую мембрану и накапливаются в цитоплазме, например, глюкоза поступает в клетку в виде глюкозо-6-фосфата. Система переноса углеводов получила название фосфотрансферазной. Перенос веществ с помощью фосфотрансферазной системы является выгодным с энергетической точки зрения. Хотя при этом и происходит затрата богатой энергией фосфатной связи фосфоенолпирувата, в процессе переноса образуется молекула глюкозы в фосфорилированной форме (глюкозо-6-фосфат), а это делает ненужным

42

фосфорилирование глюкозы за счет АТФ на первом этапе ее катаболизма.

3. Секреция продуктов жизнедеятельности бактериальной клеткой

Бактерии синтезируют и секретируют во внешнюю среду различные продукты своей жизнедеятельности. Секреция белков бактериями осуществляется с помощью различных систем и механизмов. При этом следует различать секрецию белков в периплазматическое пространство через цитоплазматическую мембрану и непосредственно в культуральную жидкость. У грамотрицательных бактерий большинство белков секретируется в периплазматическое пространство в виде белков-предшест- венников, содержащих в своей структуре особый сигнальный (лидерный) пептид из 15-40 аминокислотных остатков. Этот сигнальный пептид обеспечивает перенос белка-предшественника через цитоплазматическую мембрану, после чего отделяется от него с помощью сигнальной пептидазы.

Существует несколько моделей, объясняющих механизм, посредством которого сигнальный пептид обеспечивает секрецию белка-предшественника через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство.

Модель прямого транспорта предполагает прямое вхождение лидерного пептида в липидный бислой мембраны с использованием свободной энергии мембраноассоциированных рибосом.

Сигнальная гипотеза предполагает, что в результате взаимодействия сигнального пептида с особым рецептором мембраны образуется внутримембранный канал, через который и осуществляется секреция.

Существуют и другие, более сложные модели механизма переноса секретируемого белка через цитоплазматическую мембрану. По-видимому, применительно к разным белкам и у разных групп бактерий действуют различные механизмы секреции. Лучше всего изучены механизмы секреции белков у бактерий E.coli. У них обнаружены два пути секреции: sec-зависимый и относительно sec-независимый. Для обеспечения секреции белков по secзависимому механизму требуется участие продуктов ряда sec-генов: secA, secY, secB, secD, secE и secF. Источниками энергии для переноса белков служат гидролиз АТФ и градиент концентрации протонов. Для процессинга белка после его перемещения достаточно, по-видимому, активности только двух сигнальных пептидаз: сигнальной пептидазы I (мол. масса 36 кД, кодируется геном lepB) и сигнальной пептидазы II (мол. масса 18 кД, кодируется геном lepA).

Относительно sec-независимый механизм переноса белков используется бактериями E. coli для переноса коротких полипептидов, однако и в этом случае на ранних стадиях также участвует белок SecA.

Следует отметить, что некоторые белки секретируются непосредственно в культуральную среду. При этом в каждом конкретном случае используются различные механизмы, которые также еще недостаточно изучены. Например, бактериоцины, синтез которых кодируется генами различных плазмид, не содержат структуре сигнальных пептидов. Для их секреции через цитоплазматическую мембрану требуется специальный вспомогательный белок

43

- рилизинг-белок. Система транспорта гемолизина HlyA состоит как минимум из двух вспомогательных белков HlyB и HlyD, которые образуют канал для непосредственного выхода гемолизина из цитоплазмы во внешнюю среду.

ЛЕКЦИЯ 6. ЦИТОПЛАЗМА И ЯДЕРНЫЙ АППАРАТ БАКТЕРИЙ

План:

1.Терминология

2.Состав цитоплазмы (цитозоля) бактерий

3.Внутриклеточные структуры бактерий

4.Внутрицитоплазматические включения бактерий.

5.Ядерный аппарат бактерий

5.1Нуклеоид

5.2. Плазмиды

1.Терминология

Цитоплазма – среда, связывающая внутриклеточные структуры в единую систему.

Цитоплазмапрокариот – сложная коллоидная система, в ней нет эндоплазматическогоретикулума и других органелл, свойственных эукариотам, она неподвижна. Цитоплазма бактерий занимает основной объем клетки.

Цитозоль – это компонент цитоплазмы, полужидкая коллоидная масса, состоящая из воды (70-80%), РНК, ферментов. Таким образом, цитозоль - это жидкий матрикс, находящийся внутри клеток, присущ как для эукариотических (растительных и животных), так и прокариотических (бактерий) клеток. В эукариотических клетках он включает жидкость, заключенную в клеточную мембрану, но не в клеточное ядро, органеллы (например, хлоропласты, митохондрии, вакуоли) или жидкость, содержащуюся в органеллах. Цитозоль - это место большинства метаболических процессов, транспортирует метаболиты и участвует в передаче сигналов внутри клетки. Цитозоль и цитоплазма связаны, но эти два термина обычно не взаимозаменяемы. Цитозоль - это компонент цитоплазмы.

Цитоплазма включает цитозоль, все органеллы и жидкое содержимое внутри органелл. Цитоплазма не включает ядра. Напротив, вся жидкость внутри прокариотической клетки представляет собой цитоплазму, поскольку прокариотические клетки лишены органелл или ядра. Цитоплазма охватывает весь материал в мембране клетки, в том числе органелл, но исключая ядро. Итак, жидкость в митохондриях, хлоропластах и вакуолях является частью цитоплазмы, но не компонентом цитозоля.

В прокариотических клетках цитоплазма и цитозоль - одинаковы.

2.Состав цитоплазмы (цитозоля) бактерий

раствором. Около 70% цитозоля составляет вода.

Химический состав цитоплазмы:

- Клеточная вода (75-90 % массы вегетативной клетки) – растворитель органических и минеральных веществ, дисперсионная среда для коллоидов, источник водородных и гидроксильных ионов, а также водорода и кислорода в процессе метаболизма бактерий. В клетке находится в свободном и связанном состояниях.

- Минеральный состав. Углерод, кислород, азот, водород, фосфор и сера составляют 95% сухой биомассы клетки бактерий.

Главные физиологические функции важнейших элементов:

Водород - входит в состав воды и органического вещества клетки. Кислород - входит в состав воды и органического вещества клетки, в виде

О2 служит акцептором электронов при дыхании аэробных организмов. Углерод - входит в состав органического вещества клетки.

Азот - входит в состав белков, нуклеиновых кислот, коферментов.

Сера - входит в состав цистеина и метионина и некоторых коферментов (КоА), помимо этого сера – основной связующий элемент, обеспечивающих сшивку третичной и четвертичной структуры белка.

Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, коферментов и АТФ.

Калий, магний, марганец, кальций – кофакторы для некоторых ферментов.

Кобальт входит в состав витамина В12 (цианкобаламина) и его производных, служащих коферментами.

Железо входит в состав цитохромов и других белков.

Медь, цинк, молибден – неорганические компоненты некоторых ферментов.

Олигоэлементы в очень малых количествах стимулируют рост и развитие микроорганизмов (кадмий, ванадий, олово, серебро и др.).

Органические соединения:

1.Белки – 40-80 % массы бактерий. Протеины и протеиды.

2.Нуклеиновые кислоты – ДНК и все типы РНК.

3.Углеводы – моно- и полисахариды (внутриклеточные и внеклеточные).

4.Липиды – высшие жирные кислоты, фосфолипиды, нейтральные жиры,

воска.

5.Пигменты бактерий – растворимые и нерастворимые: каротиноиды, меланины, бактериохлорофиллы и др.

Организация и структура

На концентрацию веществ в цитозоле влияет сила тяжести, каналы в

клеточной мембране и вокруг органелл, которые влияют на концентрацию кальция, кислорода и АТФ, а также каналы, образованные белковыми комплексами. Некоторые белки также содержат центральные полости, заполненные цитозолем, состав которого отличается от внешней

45

жидкости. Хотя цитоскелет не считается частью цитозоля, его нити контролируют диффузию по клетке и ограничивают перемещение крупных частиц из одной части цитозоля в другую.

Функции цитозоля

Цитозоль выполняет несколько функций внутри клетки. Он участвует в передаче сигнала между клеточной мембраной и ядром и органеллами. Он переносит метаболиты с места их производства в другие части клетки. Это важно для цитокинеза, когда клетка делится в митозе. Цитозоль играет роль в метаболизме эукариот. У животных это включает гликолиз, глюконеогенез, биосинтез белка и пентозофосфатный путь. Однако у растений синтез жирных кислот происходит в хлоропластах, которые не являются частью цитоплазмы.

В цитозоле прокариот происходят почти все метаболические процессы.

3. Внутриклеточные структуры бактерий

1. Рибосомы (70 S) состоят из РНК (60-65%) и белка (35-40%). Рибосомы бактерии являются местом синтеза белков в клетке, в процессе которого образуются структуры, состоящие из большого числа рибосом, называемые полирибосомами или чаще полисомами. В образовании полисом принимает участие м-РНК. По окончании синтеза данного белка полисомы вновь распадаются на одиночные рибосомы, или субъединицы. Рибосомы могут располагаться свободно в цитоплазме, но значительная их часть связана с мембранами клетки. На ультратонких срезах большинства бактерий рибосомы обнаруживаются в цитоплазме в виде гранул диаметром около 20 нм.

Хроматофоры у фотосинтезирующих бактерий в виде трубочек, пузырьков, сдвоенных мембранных пластин – тилакоидов.

Хлоросомы – продолговатой формы структуры, в которых находятся бактериохлорофиллы.

Фикобилисомы– полусферические или палочковидные гранулы, расположенные на фотосинтетических мембранах, содержат водорастворимые пигменты – фикобилипротеиды.

Карбоксисомы (или полиэдральные тела) – четырехили шестигранные включения содержат фермент рибулозо-дифосфат-карбоксилазу.

Газовые вакуоли (или аэросомы) состоят из газовых пузырьков и являются регуляторами плавучести водных бактерий.

Магнитосомы – убактерий, обладающих магнитотаксисом.

4. Внутрицитоплазматические включения бактерий.

Запасные вещества - образуются в клетке в результате обмена веществ. По консистенции их делят на жидкие (поли-β-оксибутират), полужидкие (сера)

итвердые (гликоген):

1.Гранулеза

2.Гликоген

3.Углеводородные гранулы

4.Поли-β-оксимасляная кислота (поли-β-оксибутират) обнаружена только у прокариот

46

5.Полифосфаты (волютин, или метахроматиновые гранулы)

6.Включения серы

7.Включения карбоната кальция

8.Параспоральные включения

9.R-тела — нерастворимые «ленты» из белков, синтезируемые некоторыми видами бактерий. Обычно в цитоплазме бактерий эти ленты плотно свернуты в цилиндрические структуры. Они или кодирующие их гены встречаются и у некоторых видов свободноживущих бактерий, функции R-тел

уэтих бактерий неизвестны.

5.Ядерный (генетический) аппарат бактерий

Ядерный аппарат бактерий называют бактериальным ядром, или нуклеоидом (рис.22).

Рис. 22 – Нуклеоид в прокариотической клетке

Нуклеоид

По строению ядерный аппарат прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен нуклеоидом (генофором), который лишен оболочки и включает в себя почти всю ДНК бактерии. Бактериальная хромосома состоит из одной двунитевой суперспирализованной молекулы ДНК кольцевой формы плотно уложенной наподобие клубка. В отличие от эукариот, нуклеоид бактерий не имеет ядерной оболочки, ядрышка, основных белков (гистонов) и не делится митозом. В нем содержится также небольшое количество РНК и белков. Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген. Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением.

Обычно нуклеоид занимает центральный участок бактериальной клетки и ориентирован вдоль ее оси. Объем этого компактного образования не превышает 0,5 мкм3, а молекулярная масса варьирует от 1×109 до 3×109 дальтон. В определенных точках нуклеоидсвязан с клеточной мембраной.

47

В состав нуклеоида бактерий входят три компонента: ДНК. Структурные и регуляторные белки. РНК. ДНК имеет хромосомную организацию, отличную от эукариотической. Чаще всего нуклеоид бактерий содержит одну хромосому или несколько ее копий (при активном росте их количество достигает 8 и более). Этот показатель варьирует в зависимости от вида и стадии жизненного цикла микроорганизма. Некоторые бактерии имеют несколько хромосом с разным набором генов. В центре нуклеоида ДНК укомплектована достаточно плотно. Эта зона недоступна для рибосом, ферментов репликации и транскрипции. Напротив, дезоксирибонуклеиновые петли периферической области нуклеоида напрямую контактируют с цитоплазмой и представляют собой активные участки бактериального генома.

Количество белкового компонента в нуклеоиде бактерий не превышает 10%, что примерно в 5 раз меньше, чем в хроматине эукариот. Большая часть белков ассоциирована с ДНК и участвует в ее структурировании. РНК представляет собой продукт транскрипции бактериальных генов, которая осуществляется на периферии нуклеоида. Генетический аппарат бактерий является динамическим образованием, способным менять свою форму и структурную конформацию. В нем отсутствуют характерные для ядра эукариотической клетки ядрышки и митотический аппарат.

Бактериальная хромосома. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют от 3х108 до 2,5х109 дальтон. В большинстве случаев хромосомы нуклеоида бактерий имеют замкнутую кольцевую форму. Значительно реже встречаются линейные хромосомы. В любом случае эти структуры состоят из одной молекулы ДНК, которая содержит набор генов, необходимых для выживания бактерии (рис.23).

Рис. 23 Бактериальная хромосома

Хромосомная ДНК укомплектована в виде суперспирализованных петель. Количество петель на хромосому варьирует от 12 до 80. Каждая хромосома является полноценным репликоном, так как при удвоении ДНК копируется целиком. Начинается этот процесс всегда из точки начала репликации (OriC), которая прикреплена к плазматической мембране. Суммарная длина молекулы ДНК в хромосоме на несколько порядков превышает размеры бактерии, поэтому возникает необходимость в ее упаковке, но при сохранении функциональной активности. В хроматине эукариот эти задачи выполняют основные белки — гистоны. Нуклеоид бактерий имеет в своем составе ДНКсвязывающие белки, которые отвечают за структурную организацию генетического материала, а также влияют на экспрессию генов и репликацию ДНК. К нуклеоид-ассоциированым белкам относятся: гистоноподобные белки

48

HU, H-NS, FIS и IHF; топоизомеразы; белки семейства SMC. Последние 2 группы оказывают наибольшее влияние на суперспирализацию генетического материала.

Нейтрализация отрицательных зарядов хромосомной ДНК осуществляется за счет полиаминов и ионов магния. Биологическая роль нуклеоида.

Впервую очередь нуклеоиднеобходим бактериям для того, чтобы хранить

ипередавать наследственную информацию, а также реализовывать ее на уровне клеточного синтеза. Иными словами, биологическая роль этого образования такая же, как у ДНК.

Другие функции нуклеоида бактерий включают:

локализацию и компактизацию генетического материала;

функциональную упаковку ДНК;

регуляцию метаболизма.

Структурирование ДНК не только позволяет молекуле уместиться в микроскопической клетке, но и создает условия для нормального протекания процессов репликации и транскрипции. Особенности молекулярной организации нуклеоида создают условия для контроля клеточного метаболизма путем изменения конформации ДНК. Регуляция происходит за счет выпетливания определенных участков хромосомы в цитоплазму, что делает их доступными для ферментов транскрипции, или наоборот, втягивания внутрь.

Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК методами (по Романовскому-Гимзе). На электронограммах ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК, связанной определенными участками с ЦПМ или мезосомой, участвующими в репликации хромосомы.

Особенности генетического аппарат прокариот:

1)ДНК бактерий не имеет ядерной оболочки и находится в контакте с цитоплазмой;

2)нет разделения на хромосомы, нить ДНК называется бактериальной хромосомой;

3)отсутствует митоз и мейоз.

Бактериальная хромосома имеет форму замкнутого кольца – это гигантская суперспирализованная молекула ДНК, не связанная с гистонами.

Репликация ДНК осуществляется полуконсервативно.

Функционирование ДНК у бактерий организовано по оперонному принципу. Оперон — функциональная единица генома у прокариот, в состав которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие белки и объединенные под одним (или несколькими) промоторами.

Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов). Концепцию оперона дляпрокариот предложили в 1961 году французские ученые Жакоб и Моно, за что получили Нобелевскую премию в 1965 году.

49

Кроме нуклеоида в цитоплазме бактериальной клетки имеются внехромосомные факторы наследственности – плазмиды (внехромосомные детерминанты), представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК

(рис.24).

Рис. 24 Вид плазмид в прокариотической клетке

Основные свойства бактериальных плазмид:

–способность к автономной репликации;

–конъюгативность (трансмиссивность) –способность к самопередаче;

–интегрируемость;

–несовместимость;

–поверхностное исключение;

–инфекционность;

–фенотипические признаки, которые они придают бактериям: устойчивость к антибиотикам, катионам, анионам, мутагенам, бактериоцинам.

Клетки с плазмидами способны вызывать биодеградацию веществ, синтезировать бактериоцины, гемолизин, фибринолизин, токсины, антигены, антибиотики, инсектициды, пигменты, поверхностные антигены; приобретают способность к конъюгации; индуцируют опухоли у растений; осуществляют рестрикцию и модификацию ДНК.

Плазмиды могут объединяться друг с другом или с фаговыми ДНК, образуя коинтеграты. В одной клетке может находиться несколько типов плазмид.

Если плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке, их называют несовместимыми.

По расположению плазмиды бывают:

автономные;

интегрированные репродуцируются одновременно с бактериальной хромосомой – эписомы.

По передаваемости при конъюгации плазмиды различают:

трансмиссивные (F- и R-плазмиды), передаваемые при конъюгации;

нетрансмиссивные.

Функции плазмид:

1. Регуляторные компенсируют дефекты метаболизма, встраиваясь в поврежденный геном.

50

2.Кодирующие привносят в клетку новую генетическую информацию.

Виды плазмид:

1.F-плазмиды контролируют синтез F-пилей при конъюгации.

2.R-плазмиды – фактор множесственной лекарственной устойчивости.

3.Плазмидыбактериоциногении – способности бактерий продуцировать специфические вещества (колицинами илибактериоцинами), вызывающие гибель бактерий филогенетически родственных видов.

4.Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства.

5.Скрытые (криптические) плазмиды.

6.Плазмиды биодеградации.

ЛЕКЦИЯ 7. ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ. ТИПЫ РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ

План:

1.Эндоспоры, процесс спорообразования

2.Другие покоящиеся формы бактерий

3.Типы размножения бактерий

1. Эндоспоры, процесс спорообразования

Эндоспоры бактерий – особый тип покоящихся клеток. Эндоспоры формируются внутри материнской клетки, которая называется спорангием.

Отличия бактериальной эндоспоры от вегетативной клетки:

характеризуется повышенной устойчивостью к нагреванию, действию УФлучей и др. факторов;

выдерживают кипячение на протяжении двух часов;

могут длительное время сохраняться в состоянии покоя;

обладают низким уровнем метаболической активности.

Перечисленные особенности спор требуют применения особых приемов для их уничтожения.

Эндоспоры представляют стадию покоя и приспособлены к перенесению неблагоприятных условий. Споры не являются обязательной стадией жизненного цикла спорообразующих бактерий. Переход бактерий к спорообразованию наблюдается при истощении питательного субстрата. Способность образовывать эндоспоры утрачивается при пересевах вегетативных клеток.

Процесс спорообразования

Способность к образованию спор детерминируется генами spo (до 100 генов). Каждый из spo-генов отвечает за те или иные стадии споруляции.

Процесс спорообразования можно условно разделить на три этапа: Первый этап – подготовительный. На этом этапе в вегетативной клетке

бактерий прекращаются ростовые процессы, завершается репликация ДНК и изменяется метаболизм, образуется дипиколиновая кислота.

Второй этап – формирование споры – начинается с неравного деления клетки в результате инвагинации цитоплазматической мембраны. Образуется