mikrobiologiia

141

практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в

культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования кальциевого преципитата.

Для обработки клеток-рецепиентов используются грубо очищенные препараты хромосом, так как хромосомы при этом разрушаются меньше всего. Количество хромосом для обработки 1 клетки ограничено. Лучше использовать не более 20 хромосом на 1 клетку-рецепиент, так как при высоких концентрациях хромосом в суспензии они агглютинируют. Рецепиентная клетка содержит фрагменты донорных хромосом, которые могут встраиваться в геном, могут реплицироваться самостоятельно. Во введенных фрагментах часто наблюдаются делеции.

Не все клетки способны к трансформации геномной ДНК с высокой частотой. Человеческие фибробласты эффективно включают плазмидную ДНК и почти не включают геномную.

Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора. При наличии хорошего оборудования можно за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 – 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.

Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками.

Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это обусловливает его широкое применение.

Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

142

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Полученные мини-клетки очень чувствительны кразного рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10-6 – 10-7.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Липосомы – сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

4.4. Проверка культуры на содержание вектора с геном.

Ген-маркер – ген, который «легко заявляет о себе», т.е маркирует клетку и, соответственно, клон. Ген-маркер также встраивается в вектор, но с помощью другой рестриктазы. Это ген не будет иметь никакого значения в будущем биотехнологическом процессе, но он нужен для отбора продуцента целевого продукта, кодируемого рабочим геном.

Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки:

1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера – способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток.

2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

Чаще всего в качестве репортерных используются гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). К настоящему времени из этого арсенала наиболее часто используют гены GUS и GFP и, в меньшей степени, LUC и CAT. Используемый в настоящее время как репортерный ген GUS является модифицированным геном из Escherichiacoli, кодирующим β- глюкуронидазу с молекулярной массой 68 кД. GUS активен в широком диапазоне условий среды с оптимумом при рН 5-8 и 37°С.

Он может гидролизовать обширный спектр природных и синтетических глюкуронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстраты для спектрофотометрического или флюориметрического определения активности

143

фермента, а также для гистохимического окрашивания тканей insitu (например, в синий цвет). Фермент достаточно стабилен: он устойчив к нагреванию (время полужизни при 55°С составляет около 2 ч) и к действию детергентов. В процессе замораживания-оттаивания потери активности GUS не происходит. В составе химерных белков, созданных генно-инженерными методами, GUS обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GUS также весьма стабилен и активен от нескольких часов до нескольких суток.

5. Методика слияния протопластов

Клеточная инженерия – «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот.

С ее помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами.

Для обмена фрагментами хромосом у прокариот необходимо предварительно получить из их клеток лишенные клеточной стенки протопласты; затем осуществить слияние (фузию) протопластов с образованием диплоидов; полученные диплоиды инкубировать в течение нескольких часов для ломки и воссоединения кольцевых хромосомных нитей в разных вариантах. Затем суспензию протопластов высевают на твердую питательную среду, при этом часть диплоидов превращается в гаплоиды – способные к размножению клетки, которые образуют колонии. Их изучают и отбирают культуры, приобретающие новые качества, представляющие интерес для биотехнолога.

Таким образом, первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов клеточной стенки. Удалить клеточную стенку и сохранить целостность протопласта можно, лишь выровняв осмотическое давление внутри клетки и в среде.

Для получения протопластов клеточную стенку удаляют ферментативной обработкой в «гипертонической среде» с 20% раствором сахарозы или маннита, иногда с 10% раствором натрия хлорида в зависимости от определенных особенностей биообъекта. Превращение суспензии клеток в суспензию протопластов обычно контролируют методом фазово-контрастной микроскопии.

Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух

образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля.

После промывания гипертонической средой, но уже не содержащей гидролизующего клеточную стенку ферментативного препарата, протопласты высеиваются на твердую питательную среду. При этом часть диплоидов превращается в гаплоиды – способные к размножению клетки, которые образуют колонии. Однако во время нахождения протопластов в диплоидной форме в некоторых из них происходит «ломка» и воссоединение хромосомных

144

нитей, при котором в одну хромосому может включиться фрагмент другой. Таким образом, при регенерации протопластов формируются нормальные клетки, часть которых имеет гибридные хромосомы. Культуры таких клеток обладают новыми свойствами.

После протопластирования выявляются «плюс»- и «минус»-варианты продуцента по сравнению с производительностью исходной культуры. Отбор «плюс»-вариантов затруднений не вызывает, однако сложно добиться их длительного использования в производстве. Для замедления возвращения «плюс»-варинатов к исходным показателям предлагается два пути.

Первый – обработка мутагенами и отбор мутагенов с пониженной способностью к возвращению измененных участков ДНК к норме.

Второй связан с иммобиолизацией биообъектов. Можно связывать клетки с нерастворимыми носителями и использовать в производстве, не прибегая к пересевам в течение определенного времени.

ЛЕКЦИЯ 22. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА У БАКТЕРИЙ ЧАСТЬ 1

План:

1.Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии.

2.Репрессия синтеза ферментов конечным продуктом.

3.Катаболитная репрессия.

1.Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии.

Индукция фермента — это относительное увеличение скорости синтеза фермента в ответ на появление химического соединения — индуктора. Аналоги субстратов часто являются превосходными индукторами, не будучи субстратами для индуцируемых ферментов. К примеру, для р-галактозидазы таким соединением является ИПТГ — неметаболизируемый аналог лактозы ТТГ. С другой стороны, некоторые субстраты не могут быть индукторами иногда индуктором является продукт реакции, катализируемой индуцируемым ферментом. В частности, лактоза прежде чем выступить в роли индуктора, сначала должна превратиться под действием Р-галактозидазы в свой изомер — аллолактозу (1-6-0-р-Д-галак- топиранозил-глюкозу). Индуктором ферментов, участвующих в катаболизме нуклеозидов у Е. coli, является дезоксирибозо- 5- фосфат, который представляет собой промежуточный продукт катаболизма нуклеозидов.

Метаболизм многих субстратов, которые оказываются единственными источниками углерода или азота в питательной среде, связан с необходимостью их транспорта в клетку. Поступление лактозы в клетки Е. coli обеспечивает специальный ферментоподобный белок — галактозидпермеаза, синтез которого индуцируется одновременно с β-галактозидазой в результате так называемой координированной индукции. Галактоза, образующаяся под действием β - галактозидазы, в свою очередь, может индуцировать координированный синтез

145

ряда ферментов, превращающих ее в глюкозо-1-фосфат. Таким образом, полное усвоение лактозы происходит в результате последовательной индукции ферментов, пре­вращающих ее в метаболиты, которые могут быть непосредственно использованы клеткой.

В 1953 г. впервые было обнаружено, что образование триптофансинтетазы, которая катализирует последний этап биосинтеза триптофана, специфически подавляется, если бактерии получают экзогенный триптофан. В последующие годы были получены многочисленные данные, свидетельствующие о том, что добавление в ростовую среду соединения, которое является конечным продуктом какого-либо биосинтетического пути, наряду с подавлением активности первого фермента этого пути вызывает замедление или остановку синтеза всех ферментов соответствующего пути. Это явление, прямо противоположное индукции, называется репрессией ферментов или, точнее, координированной репрессией ферментов. Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза может быть увеличена, если внутриклеточная концентрация конечного продукта падает до очень низкого уровня.

Механизмы индукции и репрессии предохраняют клетку от напрасной траты аминокислот и энергии на образование ненужных в данных условиях ферментов, однако, когда появляется необходимость, эти ферменты могут быстро синтезироваться.

С помощью репрессии регулируется синтез аминокислот, пуринов, пиримидинов, витаминов и других первичных метаболитов. Следовательно, регуляция биосинтетических путей по принципу обратной связи осуществляется двумя способами: с помощью ретроингибирования и репрессии.

Были проведены специальные опыты для выяснения вопроса о соотношении между этими регуляторными механизмами. Показано, что если к культуре Е. coli, растущей на глюкозоминеральной среде, добавить низкие концентрации (от 1 до 10 мкг/мл) аргинина, то репрессии ферментов пути биосинтеза аргинина не происходит, а весь экзогенный аргинин усваивается. Очевидно, что в этих условиях действует механизм ретроингибирования, который компенсирует увеличение концентрации аргинина уменьшением собственного синтеза этой аминокислоты. Однако при добавлении аргинина в концентрации более 10 мкг/мл он используется не полностью и можно наблюдать репрессию ферментов пути биосинтеза аргинина. Ретроингибирование, следовательно, можно рассматривать как способ быстрого и тонкого регулирования биосинтеза малых молекул, тогда как репрессия осуществляет более медленное и грубое регулирование, главным образом с целью экономии синтеза белка. Оба эти механизма при совместном действии дополняют друг друга, обеспечивая максимальную экономию всех клеточных ресурсов.

Какие процессы лежат в основе индукции и репрессии ферментов? Ответ на этот вопрос был получен в результате молекулярно-генетических исследований, выполненных в основном на Е. coli. Известно, что вся генетическая информация для синтеза белка содержится в хромосоме (молекуле ДНК)и что эта информа­ция реализуется в результате последовательных процессов транскрипции и

146

трансляции. При этом сначала на соответствующем гене (участке молекулы ДНК) синтезируется информационная, или матричная, РНК (мРНК). Она служит матрицей для синтеза белка (полипептида) в процессе трансляции. Таким образом, процесс транскрипции представляет собой непосредственное проявление активности отдельных генов.

В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно на основании генетического и биохимического изучения усвоения лактозы клетками Е. coli предложили гипотезу о регуляции активности генов у бактерий, получившую широкую известность как «модель оперона». Согласно этой модели, на хромосоме имеется по крайней мере четыре компонента системы регуляции: структурный ген (или гены, контролирующие связанные биохимические функции), генрегулятор, оператор и промотор, которые составляют оперон. Ген-регулятор (R) определяет структуру белкарепрессора.

Этот белок способен связываться с оператором (О), который контролирует функционирование прилежащих структурных генов (Si, S2, S3). Промотор (Р) является начальным участком для связывания РНК-полимеразы — фермента, который катализирует транскрипцию ДНК в мРНК. Если белок-репрессор связан с оператором, то РНК-полимераза не может перемещаться (или присоединяться) к промотору и мРНК, которые комплементарны последовательности генов Si, S2 и S3, не образуются. Следовательно, соответствующие ферменты также не синтезируются.

Когда оператор свободен от белка-репрессора, РНК-полимераза, присоединившись к промотору Р, может перемещаться и транскрибировать гены Si, S2 и S3. Образование индуцибельных ферментов происходит при добавлении индуктора, который связывается с белком-репрессором и инактивирует его.

Первым из исследованных был оперон, контролирующий метаболизм лактозы (lac-оперон). Он образован генами lac Z, lacY и lac А, которые соответственно определяют синтез р-га­лактозидазы, галактозидпермеазы и ацетилтрансферазы. Синтез их координированно регулируется репрессором — продуктом гена lac I. К гену lac Z прилежат оператор (lac О) и промотор (lac Р), расположенный перед оператором.

Жакоб и Моно предположили, что репрессор представляет собой аллостерический белок, содержащий два специфических центра. Один из них обладает сродством к нуклеотидной последовательности оператора, а другой — к молекуле индуктора. Присоединение индуктора к репрессору снижает сродство первого аллостерического центра к оператору, в результате чего освобождает оператор от репрессора.

Репрессор lac-оперона был выделен и очищен. Он имеет молекулярную массу около 150000 Д и состоит из четырех идентичных субъедиииц. Каждая субъединица связывает по одной молекуле индуктора — ИПТГ. Очищенный репрессор имеет исключительно высокое сродство к специфическому 1асоператорному участку ДНК Е. coli, связывание с которым нарушается в присутствии индуктора.

Эти исследования послужили веским подтверждением гипотезы Жакоба и Моно, и в настоящее время она считается полностью доказанной.

147

Мутации в гене-регуляторе или в операторе могут нарушать образование репрессора или его связывание. В обоих случаях потребность в индукторе для синтеза ферментов исчезает. Такие мутанты называются конститутивными, поскольку у них соответствующие ферменты начинают синтезироваться постоянно.

Модель оперона применима и для репрессии ферментов. Только здесь продукт гена R является неактивным репрессором (апорепрессором), который сам по себе не способен взаимодействовать с оператором, но который может активироваться конечным продуктом (корепрессором) с образованием активного репрессора.

Репрессор (апорепрессор) триптофанового оперона был частично очищен, и механизм его действия изучен in vitro. Показано, что репрессор переходит в активную форму, связывая триптофан. Этот комплекс репрессор-корепрессор подавляет инициацию транскрипции, конкурируя с РНК-полимеразой за место связывания на промоторе.

Таким образом, индукция и репрессия представляют собой два сходных механизма: регуляции транскрипции и различие между ними заключается в природе репрессора.

Следует отметить, что объединение генов, ответственных за образование ферментов одного метаболического пути, в единый оперон не является непременным условием для регуляции их с помощью репрессии или индукции. У Е. coli гены, кодирующие ферменты биосинтеза аргинина, находятся в различных участках хромосомы, но все они контролируются одним и тем же регуляторным геном, образуя регулон. Другой пример регулона — это совокупность генов, кодирующих около двух десятков белков и ферментов, которые индуцируются в клетке в ответ на воз­действия, повреждающие ДНК, — так называемый SOSрегулон. Все они регулируются одним репрессором — продуктом гена lex А.

Опероны и регулоны, контролирующие связанные физиологические функции, обнаружены почти у всех генетически изученных видов бактерий.

В случае индукции и репрессии исследователь имеет дело с так называемой негативной регуляцией выражения генов. Существует также механизм позитивной регуляции — активация действия генов, которая осуществляется с помощью аллостерических регуляторных белков. Наиболее известные и хорошо изученные примеры такого рода регуляции — это регуляция катаболизма арабинозы и синтеза щелочной фосфатазы у Е. coli.

Продукт регуляторного гена, агаС, контролирующего арабинозный оперон, может находиться как в состоянии репрессора, так и в состоянии активатора. В форме репрессора он присоединяется к оператору и блокирует транскрипцию структурных ге­нов. Соединяясь с индуктором оперона, арабинозой, белокрегулятор переходит в форму активатора и, взаимодействуя с промоторным участком (инициатором), стимулирует транскрипцию оперона.

Щелочная фосфатаза позволяет клеткам получать фосфат за счет гидролиза органического фосфата. Неорганический фосфат среды в комплексе с продуктом гена-регулятора репрессирует синтез щелочной фосфатазы. Однако в отсутствие неорганического фосфата продукт гена-регулятора является необходимым

148

активатором синтеза щелочной фосфатазы. Этот регуляторный механизм обеспечивает высокую чувствительность синтеза щелочной фосфатазы к присутствию неорганического фосфата, который превращает активатор синтеза фермента в репрессор.

Таким образом, имеется большое разнообразие механизмов регуляции действия генов и, вероятно, не существует даже двух оперонов, которые регулировались бы одинаково.

Важным регуляторным элементом, присущим всем оперонам, является промотор, т. е. участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, чтобы начать синтез РНК. Свойствами промо­тора может быть обусловлена низкая эффективность транскрип­ции одних генов или, наоборот, интенсивная транскрипция дру­гих, а также потребность в специальных факторах для инициа­ции транскрипции. Известно, например, что ген-регулятор лактозного оперона транскрибируется, по-видимому, всего один раз в течение генерации и количество молекул репрессора не превы­шает 10 на клетку. В то же время рибосомальные гены, состав­ляющие не более 1% от всего генома Е. coli, обеспечивают до 40% одномоментного синтеза всей РНК в клетке.

Мутации могут изменять свойство промоторов, и в результате выражение соответствующих оперонов может повышаться или понижаться. Так, для выделения репрессора лактозного оперона использован мутант Е. coli с измененным промотором гена-регулятора, который интенсивно синтезировал этот белок.

2. Репрессия синтеза ферментов конечным продуктом.

Все биосинтетические пути находятся под контролем механизма репрессии конечным продуктом. Точно так же образование большинства анаболических ферментов регулируется путем репрессии их синтеза.

Репрессия осуществляется особыми присутствующими в клетке веществами - репрессорами. Факторами, модифицирующими активность репрессоров, могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также промежуточные продукты некоторых катаболических или амфиболических путей.

Репрессия может быть координированной, т.е. синтез каждого фермента данного пути в одинаковой степени подавляется конечным продуктом. Часто синтез ферментов одного пути репрессируется в разной степени. В разветвленных биосинтетических путях механизмы репрессии могут быть модифицированы (как и механизмы ингибирования), чтобы лучше обеспечить регуляцию нескольких конечных продуктов из общего исходного субстрата. Синтез многих ферментов в таких путях репрессируется только при совместном действии всех конечных продуктов. Если реакция на общем участке разветвленного пути катализируется изоферментами синтез каждого из них находится под контролем "своего" конечного продукта.

Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции стал проясняться с 50-х гг. XX в. Большой вклад в это внесли работы Ф.Жакоба и Ж.Моно. Было показано, что наряду со структурными генами, кодирующими синтез ферментов, в бактериальном геноме существуют специальные

149

регуляторные гены. Один из них - ген-регулятор (ген R), функция которого заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов). Ген-регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белкарепрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемом оператором (ген О), другой - взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора.

Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути, объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции и регуляции - оперон. Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координированно регулируются одним репрессором. Оперон представляет собой весьма рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.

Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы, катализирующей синтез иРНК, к определенному участку ДНК, называемому промотором (Р) . Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок, она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНКполимеразы и началу транскрипции.

У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют оперон. Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического белка - триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии. Последний в таком виде не связывается с операторным участком и, следовательно, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конечный продукт метаболического пути (триптофан) накапливается выше определенного уровня, он взаимодействуете репрессором и активирует его. Активированный репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию триптофанового оперона. Таким образом, триптофан является корепрессором.

3. Катаболитная репрессия.

Кроме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии.

Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легкодоступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются.

Известно, если в среде для выращивания E.coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза, сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона, ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.