mikrobiologiia

61

субстрата (X/S). Если обе эти величины выражают в весовых единицах, то отношение Х/S, называемое экономическим коэффициентом, обозначают через Y :

Y= dХ/dS, где dX – увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата

вколичестве dS.

Важность экономического коэффициента состоит в том, что он выражает количественные потребности организма в пище.

Если же урожай (в граммах) относят к числу молей потребленного субстрата, то экономический коэффициент, называемый в этом случае

молярным экономическим коэффициентом, обозначают через Уm.

Молярный экономический коэффициент Уm позволяет связать урожай клеток с полученным из какого-либо источника энергии (т. е. какого-либо субстрата) количеством АТФ (макроэргические эквиваленты). УАТФ - энергетический коэффициент, выражаемый в граммах клеточной массы на 1 моль АТФ. Этот коэффициент можно вычислить, если известен путь расщепления данного субстрата и выход АТФ в результате этого расщепления.

Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени выражается соотношением:

dS/dT = qX, где X – биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент или удельная скорость метаболизма.

Метаболический коэффициент можно выразить также через экономический коэффициент и удельную скорость роста и представить еще в таком виде:

q = /Y.

Если удовлетворены все необходимые требования, то в течение единицы времени dt увеличение биомассы dX должно быть пропорционально

количеству биомассы X и интервалу времени, т. е.: dX = Х.dt,

откуда

популяции клеток. Параметр , обозначающий скорость роста единицы биомассы (I/Х) (dХ/dt), называется удельной скоростью роста и измеряется в единицах, обратных времени (1/t).

Если постоянна, то интегрирование уравнения дает:

LnХ = LnХо + t,

где Хo – биомасса в начальный момент времени t = 0.

Для того, чтобы рассчитать время генерации клеток можно использовать уравнение, учитывая геометрическую прогрессию роста:

N = No . 2n , откуда lgN = lgNo + n lg2,

где N число клеток.

Отсюда число клеточных делений (n) составит: n = lgN-lgNo/lg2

62

Константа скорости деления или число клеточных делений в единицу времени t-to можно вычислить по формуле: ν=n/t,

а время одной генерации (g) по формуле (1): g=t/n=1/ν (1)

3. Закономерности роста чистых культур при периодическом культивировании

В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое и непрерывное.

Периодическая культура - это популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве. Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается.

Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму (рис. 25). На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: лаг-фазу; логарифмическую фазу; стационарную фазу; фазу отмирания.

Рис. 25. Основные фазы кривой роста периодической культуры микроорганизмов

Лаг-фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования. Происходит быстрое увеличение количества РНК (в 8–12 раз).

Продолжительность фазы определяется следующими факторами:

63

1)начальными условиями культивирования вносимого посевного материала;

2)возрастом посевного материала: чем старше культура, которую используют для инокуляции новой питательной среды, тем большее время занимает лаг-фаза.

Во время лаг-фазы деления клеток не происходит, отмечаются лишь процессы, которые подготавливают клетку к размножению. Лаг-фаза переходит

вначальную фазу размножения, когда клетки начинают делиться с постепенно возрастающей скоростью.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. Для

различных видов бактерий эти величины могут варьировать в значительных пределах. Например, бактерии E. Coli при 37оС делятся примерно каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter – 5–10 ч. В итоге культуры

бактерии E. Coli вступают в стационарную фазу при концентрации клеток 2– 5х109/мл.

Характеристика клеток во время логарифмической фазы:

1)все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер;

2)содержат максимальное количество РНК, белка, и количество их постоянно;

3)клетки наиболее жизнеспособны;

4)обладают высокой биохимической активностью.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. В связи с тем, что скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до его полного использования начинает снижаться и скорость роста, поэтому переход от логарифмической фазы к стационарной происходит постепенно.

Химический состав клеток зависит от фактора, лимитирующего рост. По сравнению с логарифмической фазой роста культур, клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к различного рода воздействиям. В этот период в клетках или в среде культивирования нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма.

Продолжительность этой фазы может быть от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от вида микроорганизма.

Встационарной фазе роста поведение клеток в бактериальной популяции может регулировать явление, которое получило название апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуляции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же другой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.

Вфазе отмирания происходит логарифмическое снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий существенно варьирует в зависимости от условий среды и физиологических особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий

64

рода Bacillus, скорость гибели которых происходит быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными: накопление органических кислот, автолиз, накопление антибиотиков, бактериоцинов и др.

Рассмотрим процесс образования метаболитов на разных этапах роста клетки.

Влогарифмической фазе образуются продукты, жизненно важные для роста микроорганизмов: аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д. Их называют первичными метаболитами. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов-сверхпродуцентов.

Вфазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества, не образующиеся в логарифмической фазе и не играющие явной роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном актиномицеты, грибы и спорообразующие бактерии. Промышленное получение вторичных метаболитов представляет огромный интерес, поскольку эти метаболиты – биологически активные вещества: например, антибиотики, гормоны, бактериоцины и т.д.

Приведенные сведения о метаболитах указывают на важность получения знаний об особенностях отдельных фаз при периодическом культивировании.

4. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании

В условиях непрерывного культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии логарифмического роста.

Для проточного глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы, или ферментеры. Они представляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ и т.д. Кроме того, они снабжены системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.

Ферментеры бывают нескольких типов: хемостаты, турбидостаты, оксистаты, рН-статы и др. (т.е. различаются по способу управления).

Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который с заданной постоянной скоростью поступает питательная среда. Для равномерного и полного смешивания питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с питательной средой вытекает из культиватора через сливной сифон. В хемостате прирост биомассы прямо пропорционален скорости

65

притока субстрата и удаления продуктов метаболизма. Примером хемостата в природе служит рубец жвачных животных.

Турбидостат представляет собой ферментер, в котором поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования. Когда количество биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фотоэлементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей питательной среды.

Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии, а также при проведении физиологических, биохимических и генетических исследований, так как в данных условиях наблюдается постоянная плотность популяции и концентрации всех компонентов питательной среды.

5. Синхронные культуры Синхронные культуры – это популяции микроорганизмов, в которых все

клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно. Такие культуры часто необходимы для изучения процессов обмена веществ на протяжении цикла клеточного деления.

Синхронизировать рост и деление клеток в какой-либо популяции можно с использованием различных приемов, таких как: изменение температуры; изменение интенсивности освещения (для фототрофных микроорганизмов); лимитирование количества питательных веществ (т.н. «метаболический шок» - когда сначала выращивают бактерии на голодном пайке, а потом вносят в среду необходимые питательные вещества); фильтрование суспензии клеток микроорганизмов через специальный фильтр, позволяющий отобрать клетки одного размера; центрифугирование. Несмотря на разнообразие методов, которые могут привести культуру к синхронному размножению, не всегда удается в достаточной степени синхронизировать деление клеток. В таких случаях принято сочетать различные методы. Однако в синхронизированном состоянии культура не может находиться длительное время и после двух-трех генераций процесс деления клеток асинхронизируется.

Синхронизации деления подвергались различные объекты: грибы, бактерии, простейшие, водоросли, а также клетки культуры тканей растений и животных.

6. Культивирование иммобилизированных клеток микроорганизмов

Важным направлением микробиологии и биотехнологии является производство и использование иммобилизованных ферментов. Ферменты по многим своим свойствам, прежде всего активности и специфичности, намного превосходят химические катализаторы. Ферменты обеспечивают протекание биохимических реакций без высоких температур и давлений, а ускоряют их в миллионы и миллиарды раз. Но здесь возникает принципиальное затруднение: многие ферменты после их извлечения из клетки очень быстро инактивируются и разрушаются. Многократно их нельзя использовать.

66

Было найдено следующее решение проблемы. Для того чтобы стабилизировать (иммобилизировать) ферменты, сделать их пригодными для многократного длительного промышленного использования, ферменты присоединяют к нерастворимым либо растворимым носителям.

Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют два принципиально различных подхода к иммобилизации:

1)химические методы;

2)физические методы.

Химические методы иммобилизации предполагают образование ковалентной связи между какой-либо из функциональных групп на поверхности клетки микроорганизма и материалом носителя. Эти методы применяются сравнительно редко, так как клетки в этом состоянии могут терять нужную активность.

Физические методы иммобилизации реализуются в результате адсорбции микроорганизмов на поверхности различных нерастворимых синтетических или природных пористых материалов, при включении клеток в поры поперечносшитого геля и т. п. Например, при смешивании суспензии клеток бактерий с раствором полимера (например, полиакриламида, агарозы) с последующей полимеризацией образуется пространственная структура геля. В этом геле микроорганизмы оказываются заключенными в ячейки, которые ограничивают их перемещение, но не препятствуют поступлению питательных веществ и прохождению каталитических функций.

В настоящее время активно разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат. Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом облегчается выделение продуктов биосинтеза.

Иммобилизованные ферменты находят применение в медицине. Например, для лечения сердечно-сосудистых заболеваний разработан препарат «стрептодеказа». Этот препарат можно вводить в сосуды для растворения образовавшихся в них тромбов. Растворимая в воде полисахаридная матрица, к которой химически привязана стрептокиназа, значительно повышает устойчивость фермента, снижает его токсичность и аллергическое действие, не влияет на активность и способность фермента растворять тромбы.

Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение также в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ; в деградации токсичных природных и неприродных соединений, промышленных отходов; для очистки сточных вод от загрязнений. На основании таких исследований получило развитие новое направление биотехнологии – инженерная энзимология. Успехи в этой области существенно

67

преобразили прикладную микробиологию, техническую биохимию и ферментную промышленность.

ЛЕКЦИЯ 10. ДЕЙСТВИЕ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

План:

1.Влияние химических факторов на микроорганизмы

1.1.Влияние концентрации водородных ионов (рН среды)

1.2.Окислительно-восстановительные условия среды.

2.Действие химических веществ на микроорганизмы

3.Консерванты

4.Антибиотики

Факторы внешней среды, которые влияют на жизнеспособность микроорганизмов, подразделяют на химические и физические. Действуют на микроорганизмы двояко:

1)оказывают стимулирующее действие;

2)могут вызывать торможение метаболизма либо приводить к гибели.

В этом случае все факторы подразделяют на микробостатические и микробоцидные.

Микробостатические факторы полностью либо частично угнетают рост и задерживают развитие микроорганизмов. Микробоцидные факторы вызывают гибель микроорганизмов. В зависимости от концентрации и дозы агента, продолжительности контакта и вида микроорганизма, один и тот же фактор может оказывать и микробостатическое, и микробоцидное действие.

1. Влияние химических факторов на микроорганизмы

Влияние концентрации водородных ионов (рН среды)

В зависимости от отношения к рН среды микроорганизмы делятся на три группы:

•нейтрофилы - предпочитают нейтральную реакцию среды. Растут в диапазоне значений рН от 4 до 9. К нейтрофилам относятся большинство бактерий, в то числе гнилостные бактерии;

•ацидофилы (кислотолюбивые). Растут при рН 4 и ниже. К ацидофилам относятся молочнокислые, уксуснокислые бактерии, грибы и дрожжи.

•алкалофилы (щелочелюбивые). К этой группе относятся микроорганизмы, которые растут и развиваются при рН 9 и выше. Примером алкалофилов является холерный вибрион.

Если рН не соответствует оптимальной величине, то микроорганизмы не могут нормально развиваться, так как активная кислотность оказывает влияние на активность ферментов клетки и проницаемость цитоплазматической мембраны.

Некоторые микроорганизмы, образуя продукты обмена и выделяя их в среду, способны изменять реакцию среды.

68

Для бактерий кислая среда более опасна, чем щелочная (особенно для гнилостных бактерий). Это используется для консервирования продуктов путем маринования или квашения. При мариновании к продуктам добавляют уксусную кислоту, при квашении создаются условия для развития молочнокислых бактерий, которые образуют молочную кислоту и тем самым способствуют подавлению роста гнилостных бактерий.

Окислительно-восстановительные условия среды.

Степень аэробности среды (насыщения среды кислородом) может быть охарактеризована величиной окислительно-восстановительного потенциала, который выражают в единицах гН2. В среде, окислительные свойства которой соответствуют насыщению среды кислородом rН2 = 41. В среде с высокими восстановительными условиями гН2 = 0. При равновесии окислительных и восстановительных процессов гН2 = 28.

Облигатные анаэробы (микроорганизмы, для которых кислород является ядом) живут при гН2 меньше 12-14, но размножаются при rH2 менее 3-5. Факультативные анаэробы (микроорганизмы, способные расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях) развиваются при rH2 от 0 до 20-30, а аэробы - при гН2 от 12-15 до 30.

Регулируя окислительно-восстановительные условия среды можно затормозить или вызвать активное развитие той или иной группы микроорганизмов. Например, в виноделии, для предотвращения развития уксуснокислых бактерий емкости с вином нужно заполнять полностью, чтобы снизить степень насыщения среды кислородом.

Химические вещества.

Многие химические вещества действуют губительно на микроорганизмы. Такие вещества называют антисептиками. Их действие зависит от концентрации и продолжительности воздействия, а также от рН среды и температуры.

Из неорганических соединений наиболее сильно действуют на микроорганизмы соли тяжелых металлов (золота, меди и, особенно, серебра). Например, ионы серебра адсорбируются на поверхности клетки, вызывая изменения свойств и функций цитоплазматической мембраны.

Бактерицидным действием обладают многие окислители (хлор, йод, перекись водорода, калий марганцево-кислый), минеральные соли (сернистая, борная, фтористо-водородная). Эти вещества вызывают активные окислительные процессы, не свойственные метаболизму клетки, а также разрушают ферменты.

Органические соединения (формалин, фенол, карболовая кислота, спирты, органические кислоты - салициловая, уксусная, бензойная, сорбиновая) также могут губительно воздействовать на микроорганизмы.

Органические соединения вызывают коагуляцию клеточных белков, растворяют липиды и т.д. Бактерицидным действием обладают также эфирные масла, дубильные вещества, многие красители (фуксин, метиленовая синь, бриллиантовая зелень).

69

Многие химические вещества используются в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности как дезинфицирующие вещества. Дезинфицирующие вещества вызывают быструю (в течение нескольких минут) гибель бактерий. Они более активны в средах бедных органическими веществами. Уничтожают не только вегетативные клетки, но и споры. Они не вызывают появления устойчивых форм микроорганизмов. В пищевой промышленности в качестве дезинфицирующих веществ применяют вещества, содержащие активный хлор (хлорамин, хлорная известь и т. д.).

Применение антисептиков для консервирования пищевых продуктов ограничено, к использованию допущены немногие химические консерванты (бензойная, сорбиновая кислоты и их соли) в малых дозах (от сотых до десятых процента).

2. Действие химических веществ на микроорганизмы Химические соединения по механизму действия на клетки

микроорганизмов могут быть разделены на две группы:

1) повреждают клеточную стенку либо цитоплазматическую мембрану; 2) повреждают ферменты, которые участвуют в обмене веществ, либо

нарушают синтез основных биополимеров клетки.

К первой группе относятся следующие химические вещества:

-повреждают структуру клеточной стенки – лизоцим и др.;

-нарушают полупроницаемость цитоплазматической мембраны -

фенолы, хлороформ, крезолы, нейтральные мыла, поверхностно-активные вещества или детергенты, эфиры, ионы водорода, спирты, толуолы.

К группе химических веществ, которые повреждают ферменты и нарушают обмен веществ, относятся ионы тяжелых металлов, оксид углерода, цианиды, некоторые активные окислители – перманганат калия, пероксид водорода, хлорная известь, иод. Также ко второй группе химических веществ,

которые нарушают синтез клеточных компонентов, относятся структурные аналоги соответствующих соединений – антиметаболиты. Например, структурным аналогом сукцината является малонат.

3. Консерванты

К микробостатическим агентам, которые ограничивают рост нежелательной микрофлоры в продуктах питания, косметике и др. продуктах, относятся консерванты. Консерванты не должны обладать токсичными, мутагенными, канцерогенными свойствами по отношению к организму человека.

Основные консерванты:

1)наименее токсичными и чаще других применяемыми консервантами являются поваренная соль и сахар;

2)широко используются органические кислоты: лимонная, молочная, уксусная и др., а также их соли;

3)для консервирования фруктов, ягод, соков, вин используют диоксид серы (SO2), а также жидкие сульфиты;

70

4) для консервирования мясных и рыбных продуктов широко применяют нитриты и нитраты, которые эффективно ингибируют рост таких опасных возбудителей, как Clostridium botulinum, вызывающих порчу богатых белком продуктов.

4. Антибиотики

Антибиотики – низкомолекулярные продукты метаболизма микроорганизмов, растений и животных либо их модификации, которые задерживают рост либо полностью подавляют развитие других микроорганизмов.

К настоящему времени выделено и описано более 3000 антибиотиков. Примерно 50 % известных антибиотиков синтезируются штаммами, которые принадлежат к актиномицетам - к роду Streptomyces. Среди бактерийпродуцентов следует выделить бактерии рода Bacillus. Способность к синтезу антибиотиков не является строго специфическим признаком. Один и тот же антибиотик может образовываться микроорганизмами, которые относятся к разным видам, родам и даже порядкам. Кроме того, штаммы, принадлежащие к одному виду, могут синтезировать разные антибиотики.

Антибиотики в химическом отношении представляют гетерогенную группу соединений: это низкомолекулярные вещества; молекулы одних антибиотиков состоят только из атомов С и Н, но чаще из С, Н, О и N; другие антибиотики содержат также атомы серы, фосфора и галогенов; в молекулах антибиотиков представлены почти все функциональные группы, известные в органической химии; могут быть получены в кристаллическом виде.

Выделяют следующие группы антибиотиков: противовирусные,

антибактериальные, антипротозойные, противогрибковые, противоопухолевые. В соответствии с активностью в отношении грамположительных и

грамотрицательных бактерий антибиотики можно разделить на две группы:

1)Антибиотики с узким спектром действия – их большинство, они действуют на грамположительные бактерии.

2)Антибиотики широкого спектра действия – они активны в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

По механизму антимикробного действия антибиотики можно разделить на несколько групп: ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины и др.); вызывающие повреждение цитоплазматической мембраны (грамицидины, полиены, трихомицин и др.); ингибиторы синтеза РНК (рифампицины и др.); ингибиторы синтеза ДНК (митомицин С, противоопухолевые и др.); ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, канамицин, эритромицин, тетрациклины и др.).

Практическое использование антибиотиков: при лечении инфекционных заболеваний человека и животных; для защиты растений от болезней, вызываемых бактериями и грибами; для стимуляции роста сельскохозяйственных животных; для предотвращения порчи мяса, рыбы и других продуктов; в качестве инструментов для биологических исследований.