10.Возможности использования клеточных культур, бактерий, грибов, ферментов и изолированных органов как тест систем в доклинических исследованиях.

Часто тест-системами в доклинических исследованиях являются животные, но также могут быть ферменты, бактерии, органы или отдельные группы клеток. Тест-система в доклинических исследованиях представляет собой любую систему на которую воздействуют исследуемым веществом.

Бактериальные тест-системы могут применяться для: - определения острой и хронической токсичности, - определения чувствительности возбудителя, - изучения химиотерапевтической эффективности антибиотиков, - моделирования инфекционного состояния у животных, - изучения генотоксичности (тест Эймса) и т.д. В эксперименте должны использоваться бактериальные культуры со здоровым ростом и высоким титром жизнеспособных бактерий. Бактериальные культуры должны быть выращены до конца экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста (приблизительно 109 клеток/мл). Необходимо отметить что культуры в конце стационарной фазы не должны быть использованы. Микроорганизмы в силу своей убиквитарности и высокой биологической пластичности быстро реагируют на изменение окружающей среды. В связи с этим они могут быть использованы не только для оценки токсичности химических веществ, но и как индикаторы качества окружающей среды. На простых моделях (E.Coli) исследуются подвижность, хемотаксис, метаболическая активность, интенсивность размножения этих биологических объектов, как показатель степени токсичности различных веществ. Для создания модели инфекционного заболевания у животного необходимо использовать тот путь инфицирования, который соответствует естественному пути заражения человека данной инфекцией. При отсутствии у животного чувствительности к патогенному возбудителю, используют другие пути заражения с учетом тяжести течения инфекции, при этом очень важен выбор сроков наблюдения за инфицированными животными. Рекомендуемый набор культур для воспроизведения инфекции включает: стафилококки (плазмокоагулирующий и коагулазонегативный штаммы, антибиотикочувствительные и антибиотикоустойчивые с различным набором маркеров резистентности, в том числе метициллинрезистентные), стрептококки (гемолитический и зеленящий), пневмококки (чувствительные к бензилпенициллину и пенициллинрезистентные); различные виды энтеробактерий антибиотикочувствительные и множественноустойчивые (эшерихии, клебсиеллы, протеи, шигеллы, сальмонеллы), псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии, возбудители газовой гангрены, дрожжеподобные грибы Candida и др.

В системе доклинического исследования лекарственных препаратов первым этапом является оценка токсичности соединения для культуры клеток и лабораторных животных. Преимуществами такого исследования являются: способность оценить большое количество веществ в различных дозировках за короткий срок, обладает высокой воспроизводимостью, высокой чувствительностью, в исследовании in vitro возможно использование клеток человека, что позволяет свести к минимуму возможность получения негативных результатов при клинических испытаниях, так как положительные результаты, полученные на материале животных, не всегда адекватно экстраполируются на организм человека, а также использование клеточных структур позволяет значительно лучше прояснить возможный механизм действия исследуемого вещества. Как правило, в процессе исследования токсичности соединений изучают влияние различных концентраций препарата на морфологию клеток. Однако в связи с тем, что различные типы и линии клеток неодинаково чувствительны к воздействию лекарственных препаратов, оценку их эффективности нередко проводят с использованием нескольких типов и линий клеток. Использование нескольких культур клеток позволяет более достоверно осуществлять оценку токсичности существующих и новых лекарственных соединений. Безусловно, эксперименты на животных крайне важны для сохранения здоровья человека, но эти исследования являются трудоемкими и дорогостоящими, а также они травмируют подопытных животных и приводят к их гибели. Поэтому сегодня вполне обоснованны усилия ученых, направленные на максимальное сокращение количества животных и замену их альтернативными моделями и тест-системами в условиях in vitro. Всемирная организация здравоохранения, международное медико-биологическое общество не только одобряют, но и настоятельно рекомендуют и поддерживают использование альтернативных моделей и методов. Эксперименты в условиях in vitro становятся повседневной практикой в деятельности научно-исследовательских институтов экологического и гигиенического профиля, органов, контролирующих состояние окружающей среды.

Основное применение экспрессируемых ферментов-является проведение реакции фенотипирования для лекарств кандидатов. Метаболизм системой цитохром Р 450 является основной для ликвидации лекарственного средства. Таким образом, выявление относительного вклада каждой изоформы на общий печеночный клиренс является важной задачей. Данные о метаболизме системой цитохром Р 450 в сочетании с данными других неметаболических путей, таких как почечный и билиарный клиренс могут дать полную картину клиренса лекарственного средства. Второе применение экспрессируемых ферментов является качественное определение причастности цитохромов Р 450 к метаболическому пути. Этот анализ обеспечивает важную информацию о том, как исследуемый препарат метаболизируется одной изоформой или несколькими, и, кроме того, являются ли высоко полиморфные ферменты, такие как CYP2D6 и CYP2C19, основными факторами, способствующими метаболическому клиренсу. Следует отметить, что, печеночный метаболизм осуществляется системой цитохром Р 450, но так же стоит отметить значительный вклад в общий метаболизм других ферментов. Примеры не-цитохромных Р 450 микросомальных или цитозольных ферментов часто участвующих в метаболизме лекарственных средств включают: флавин-содержащую монооксигеназу, уридиндифосфат-глюкуронилтрансферазу, сульфотрансферазу и альдегид оксидазу. Кроме того, системы цитохром Р 450 концентрированные ферменты с высокой активностью по отношению к конкретному субстрату часто используются в качестве "биореакторов", для генерации метаболитов представляющих интерес для дальнейшего исследования. Используя сгенерированные метаболиты, которые собираются в качестве хроматографических фракций, можно проверить фармакологическую активность без необходимости определения структуры метаболита. В этом отношении, высокая активность и селективность, экспрессируемых ферментов обеспечивают превосходную альтернативу использованию человеческих микросомах печени, т.к. микроомы печени генерируют большое количество метаболитов. Наличие дополнительных метаболитов добавляет трудности для хроматографического разделения. Высокая стоимость систем цитохром Р 450 обеспечивает свои собственные проблемы.

Изолированные органы как тест-система в доклинических исследованиях Ex Vivo показатели имеют ряд преимуществ перед другими системами тестирования. В настоящее время используются при открытии новых лекарств. Ex Vivo метрическая система также функционально превосходит ткани и клеточные анализы, поскольку она обеспечивает полный набор интактных функций и условий, в том числе в физиологическом присутствии внеклеточного матрикса, сосудистой сети, гормональных и других эндогенных веществ. В будущем, Ex Vivo система будет адаптирована для изучения больных органов, в том числе с вирусными или бактериальными инфекциями, воспалением, опухолью или заболеваний связанных с обменом веществ, таких как диабет; эта способность будет иметь огромное значение, особенно, когда подходящие животные модели ограничены или недоступны. Ex Vivo исследования органов также имеют ряд преимуществ перед In Vitro исследованиями с точки зрения разработки лекарств. Например, Ex Vivo исследования органов позволяют наблюдать непосредственное воздействие соединения на уровне органов и выделить отдельные компоненты от валового эффекта. Это обеспечивает более глубокое понимание того, каким образом препарат взаимодействует с отдельными системами человека и как такие системы взаимодействуют друг с другом. Для сравнения, в клинических испытаниях, может наблюдаться только общий эффект лекарственного средства. Перфузионные изолированные органы также позволяют лучше контролировать концентрацию лекарственного средства. Также систематически оценена может быть диета, возраст или доза препарата. Чтобы определить потенциал лекарственных взаимодействий возможно оценить несколько соединений одновременно. Преимущества, связанные со сбором данных включают в себя возможность постоянно контролировать систему во время экспериментов и легкость сбора проб. Данная модель исследования имеет ряд ограничений. Одним из ограничений этого способа исследований является то, что перфузируемые органы отделены от иммунной и центральной нервной систем. Некоторые итоги токсичности, такие как бактериальные и вирусные инфекции, взаимодействуют между патогенным микроорганизмами и иммунитетом хозяина. В таких ситуациях, выбранные органы не могут полностью имитировать естественные инфекции. Тем не менее, некоторые аспекты иммунной и нервной систем поддерживаются или могут быть смоделированы Ex Vivo исследованиями. Например, врожденный иммунный ответ присутствует в некоторых органах, а также системы перфузии позволяют иммунным клеткам быть в управляемом режиме, для оценки их вклада в токсичность. Вклад нервной стимуляции в токсичность может быть воспроизведен с помощью электрической стимуляции соответствующих нервов.