Протисты / Карпов С.А. Строение клеток протистов

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ного цвета. Это дает возможность одновременно определить локализацию 2–3 белков в клетке. В последнее время появилась возможность определять при помощи меток концентрацию и локализацию ферментов внутри живой клетки.

Усиление контраста при помощи дополнительных устройств

Использование контрастирующих устройств позволяет наблюдать живые клетки. Фазово-контрастное и дифференци- онно-контрастное устройства основаны на использовании одного феномена – смещение волны света по фазе при прохождении его сквозь плотный объект (скажем, ядро) по отношению к волне света, проходящей сквозь менее плотный объект (цитоплазма) (рис. 3.3).

Рис. 3.3. Два способа получения контраста в световой микроскопии.

А – окрашенная клетка (ок) уменьшает амплитуду длины волны проходящего света, поэтому можно видеть изменение цвета. Б – у света, проходящего сквозь неокрашенную клетку (нк), почти не меняется амплитуда, но происходит смещение по фазе, поэтому после прохождения объекта волны находятся в противофазе, что вызывает изменение интенсивности света. Это различие можно усилить при помощи фазово-контрастного и интерференционно-контрастного устройств.

120

 фазово-контрастном микроскопе структуры клетки выглядят более темными, контрастными, чем в обычном микроскопе, а при больших увеличениях вокруг них образуется светлый ореол, затрудняющий рассмотрение деталей строения клетки.

Интерференционный контраст (оптика Номарского) создает впечатление объемного изображения клетки. Изображение при использовании оптики Номарского получается без ореола

èвыгдядит более детальным.

Ñразвитием электронных систем эта техника была применена и к интерференционно-контрастным микроскопам. В на- чале 80-х была создана видеомикроскопия, которая позволила различать на живых клетках отдельные микротрубочки, диаметр которых составляет 0,025 мкм, что почти в 20 раз меньше длины световой волны. Для того, чтобы это стало возможно, нужно было уменьшить интенсивность освещения, т.к. человеческий глаз не может улавливать слабые различия в освещенности структур на ярком общем фоне, и, соответственно, усилить слабый сигнал, поступающий от объекта. Для усиления сигнала была применена чувствительная видеокамера, сигнал от которой превращался в цифровое изображение и выводился на экран монитора. Полученное изображение можно было обрабатывать средствами электроники, которые позволяли менять увеличение, яркость и контраст в широких пределах. Этот метод оказался особенно перспективным для усиления сигнала от слабых флюоресцентных меток, применяемых на живых объектах.

Для изучения собственно одноклеточных протистов описанных методов световой микроскопии вполне достаточно, т.к. клетки имеют небольшие размеры и световой пучок их легко просвечивает. Однако для исследования некоторых аспектов жизнедеятельности паразитических протистов бывает важно проследить положение клетки в тканях хозяина, не используя при этом обычные методы фиксации, заливки, резки с последующим изучением срезов материала. Для исследования крупных объектов, их трехмерной реконструкции используется конфокальный микроскоп. Упрощенная схема, иллюстрирующая принцип его работы, показана на рисунке 3.4.

121

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

Рис. 3.4. Упрощенная схема строения современного конфокального микроскопа.

Лазерное излучение проходит сквозь «игольное ушко» и, отражаясь от дихронного зеркала, фокусируется в одной точке на объекте (А); он возбуждает молекулы флюоресцентного красителя, который генерирует излучение большей длины волны. Свет от объекта проходит сквозь дихронное зеркало и фокусируется в конфокальном «игольном ушке», попадая сквозь него на детектор (Д) (Б). Весь посторонний свет, отражающийся от других частей объекта, практически не проходит сквозь «игольное ушко» и, таким образом, не маскирует необходимое нам излучение (В).

Принципиально он устроен так же, как флюоресцентный микроскоп (рис. 3.2). Однако имеется 2 главных отличия. Источником света вместо ртутной лампы служит лазер, свет от которого проходит сквозь очень маленькое отверстие, чье изображение фокусируется на одной определенной точке объекта, проходя через обычную систему двухронных зеркал. Флюоресцентное свечение от объекта фокусируется в другом (конфокальном) отверстии, откуда идет на воспринимающий детектор. Весь свет, который отражается от частей объекта, находящихся вне фокуса, отсекается и не маскирует нужное нам изображение. Таким образом, точечное изображение источни-

122

ка света фокусируется на объекте, и только от объекта отраженный свет попадает сквозь конфокальное отверстие на детектор. Сканируя объект лучом лазера, мы получаем очень точные двухмерные изображения, которые можно анализировать и создавать при помощи компьютера трехмерное изображение интересующих нас структур.

Электронная микроскопия

В электронном микроскопе используется принципиально иной источник света. Вместо видимого света – поток электронов, длина волны которого составляет всего 0,004 нм. Следовательно, теоретически мы можем получить разрешение около 0,002 нм, или 0,02Å (рис. 70). Для сравнения, размер атома водорода в 10 раз больше. Однако на практике паспортное разрешение микроскопа в 1,2-1,4 Å уже считается идеальным. Особенности приготовления биологических объектов для электронной микроскопии и различные погрешности при просмотре таковы, что на практике разрешение в просвечивающем электронном микроскопе составляет около 2 нм. Тем не менее, это в 100 раз выше разрешения светового микроскопа, и позволяет рассматривать микрофиламенты диаметром 2–4 нм.

Устройство просвечивающего (ПЭМ) и сканирующего (СЭМ) электронных микроскопов в сравнении со световым показано на рисунке 3.5.

Источником эмиссии электронов является нить накала катода. Рядом с ней располагается анод. Под действием ускоряющего напряжения (80–100 Кв для ПЭМ, и 30–40 Кв для СЭМ) пучок электронов направляется по узкому туннелю колонны микроскопа, проходит сквозь объект и попадает на флюоресцирующий экран, на котором и формируется изображение. Для улучшения качества изображения в колонне создается вакуум, пучок электронов формируют магнитные линзы (по аналогии со стеклянными линзами в световом микроскопе). Чтобы на экране получилось четкое изображение, объект должен быть, с одной стороны, прозрачным для электронов, т.е. достаточно тонким (50–100 нм), а с другой стороны, структуры его должны быть достаточно плотными и могли отклонять электроны так, чтобы на экране под ними получались соответствующие им тем-

123

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

Рис. 3.5. Сравнение светового (А) и электронных просвечивающего (Б) и сканирующего (В) микроскопов. Показано принципиальное сходство основных рабочих узлов. Отличие электронных микроскопов: объект помещен в вакуум, источник излучения – поток электронов, вместо стеклянных используются магнитные линзы.

д – детектор, ис – источник света, кл – конденсорные линзы, л – линза, м – монитор, об – объект, ок – окуляр, ол – объективная линза, оу – отклоняющее устройство, пл – проекторная линза, фэ – флюоресцентный экран.

ные пятна и полосы. Это чередование на экране электронноплотных (темных) и электронно-прозрачных (светлых) полос

èпредставляет собой изображение объекта. Для окраски (контрастирования) биологических объектов обычно используют соли тяжелых металлов (свинца и урана), которые, оседая на клеточных структурах, делают их непрозрачными для электронов.

Процесс приготовления объектов для ПЭМ довольно сложен

èимеет много нюансов. Однако эта процедура уже давно стала рутинной и для овладения ею требуется лишь практика.

Наилучшими фиксаторами для ЭМ являются глутаровый альдегид и четырехокись осмия (рис. 3.6), которые образуют кова-

124

Рис. 3.6. Структурные формулы молекул глутарового альдегида (А) и четырехокиси осмия (Б).

лентные связи с макромолекулами объекта по месту двойных связей.

Оба фиксатора дополняют друг друга. Глутаральдегид связывает преимущественно белки, а четырехокись осмия – жиры. Углеводы практически не взаимодействуют с этими фиксаторами.

После фиксации клетки обезвоживаются в спиртах и заливаются в полимерные материалы, которыми обычно служат эпоксидные смолы. В результате полимеризации при определенных условиях смолы затвердевают, при этом не меняя своего объема, т.е не искажая форму клетки. На специальном приборе (ультрамикротоме) получают ультратонкие срезы, которые помещаются на маленькие ненамагничивающиеся сетки (обыч- но из меди, вольфрама или платины) и контрастируются уранилацетатом и цитратом свинца. После этого сеточки с объектом помещаются в микроскоп и просматриваются при нужном увеличении.

В СЭМ используется тот же основной принцип формирования пучка, но изображение формируется иначе (рис. 3.5). Здесь исследуется поверхность объекта, которая должна быть достаточно плотной, чтобы от нее отражались электроны. Для этого объект покрывается (напыляется) тонким слоем тяжелого металла (золото, платина, сплав платины с палладием) и монтируется на специальный столик, который позволяет поворачи- вать и наклонять объект. Отраженные от поверхности объекта вторичные электроны улавливаются детектором, который усиливает сигнал и подает его на монитор, где формируется изоб-

125

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

126

Рис. 3.8. Метод замораживания-скалывания (А) и замораживаниятравления (Б).

В обоих случаях объект быстро замораживается и раскалывается. Затем

(А) получают реплику непосредственно со скола (см. рис. 3.7), или (Б) помещают в вакуум, где часть цитоплазмы сублимируется и обнажаются внутренние структуры клетки, а затем изготавливается реплика.

вл – выпаренный лед, вц – выпаренная цитоплазма, вч – внутримембранные частицы, нпм – наружная плазматическая мембрана и поверхность органелл, пм – плазматическая мембрана.

угольной) и покрывают на 1 минуту раствором соли какого-либо тяжелого металла (фосфорно-вольфрамовой кислоты или уранилацетата). После высушивания сеточку с объектом помещают в ПЭМ и просматривают. Прозрачные для электронного пуч- ка макромолекулы и другие органические структуры выглядят светлыми на темном фоне, образованном солями тяжелого металла, который не прозрачен для электронов. Таким способом, в частности, определяют строение мастигонем на поверхности жгутиков, структуру вирусов, строение клеточной стенки бактерий.

Метод замораживания-скалывания

Метод получения реплик используется также для изучения внутреннего строения мембран (рис. 3.8).

Для этого клетки быстро замораживаются до температуры жидкого азота (-196° С). Обычно это происходит в присутствии антифриза, который предотвращает образование в клетке кристаллов льда, разрушающего клеточные структуры, или процесс замораживания идет при температуре жидкого пропана (-80° С), а потом объект помещается в жидкий азот. Затем заморожен-

127

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ная клетка раскалывается лезвием бритвы, и поверхность скола напыляется платиной. Далее процедура та же, что и при получе- нии реплики с целого объекта: органический материал удаляется, а реплика просматривается в ПЭМ. Сколы обычно проходят таким образом, что расщепляют мембраны, и мы можем наблюдать их внутреннее строение. Чаще всего таким образом изуча- ют распределение внутримембранных белков.

Метод замораживания-травления (фризэтчинг)

Этот метод позволяет изучать как внешние, так и внутренние структуры клетки (рис. 3.8). После быстрого замораживания клетки, с нее получают скол, но перед напылением ее помещают в вакуум, где при низкой температуре происходит возгонка льда. В результате обнажаются более глубокие структуры клетки. После этого объект напыляют, затем растворяют, как и в предыдущем методе, и полученную реплику просматривают в ПЭМ. Этот метод дает прекрасные результаты при изучении скелетных структур, т.к. позволяет наблюдать трехмерную картину содержимого клетки.

Криоэлектронная микроскопия

Этот метод требует достаточно сложного оборудования. Объект сначала замораживают, затем получают с него срез на криоультрамикротоме толщиной не более 100 нм. Полученный срез помещают на сеточку, которую тут же вставляют в электронный микроскоп. При этом температура объекта должна сохраняться на уровне -160° С, для чего используется специальный держатель. В вакууме микроскопа происходит возгонка льда и можно наблюдать нативные структуры клетки ничем не окрашенные, но и вполне контрастные. Так были получены фотографии вирусов и белковых филаментов мышц насекомых.

Методы криофиксации (без использования химических веществ) важны и в теоретическом плане. При сложном способе химической фиксации и последующей процедуре приготовления объекта для ПЭМ всегда остается сомнение в истинности получаемой картины. Криометоды позволили получить очень близкие результаты в отношении строения клетки и убедили исследователей в том, что современные химические способы фиксации не вызывают артефактов.

128

ГЛАВА 4

Строение клетки протистов

Протисты являются эукариотами, поэтому им свойственны те же основные системы (поверхностный аппарат, цитоплазма и ядро), какие мы встречаем в клетках многоклеточных животных и растений. В цитоплазме протистов обнаруживаются митохондрии и хлоропласты, аппарат Гольджи и пероксисомы. В то же время, их клетки имеют множество морфологических особенностей, которые встречаются только у протистов. Наиболее разнообразны различные цитоскелетные образования, к которым можно отнести как внутренние цитоплазматические структуры, так и как наружные образования (покровы), и, кроме того, минерализованные скелетные элементы. По-видимому, именно развитие цитоскелета, как основной интегрирующей системы клетки, отличает протистов от клеток других эукариот, поэтому, помимо обычного набора органелл, особое внимание будет уделено строению цитоскелета, а также структурам, характерным только для протистов.

4.1. Покровы

Как у всякой эукариотной клетки, основу покровов протистов составляет плазмалемма, образованная поверхностной мембраной и прилегающим к ней снаружи слоем гликокаликса. Поверхностная мембрана образована билипидным слоем, и на электронограммах выглядит как трехслойная структура. Она обычно содержит внутримембранные частицы, или интегральные белки. Эти частицы часто образуют правильные агрегаты, которые выявляются на сколах при расщеплении мембраны. Назначение этих агрегаций не установлено. В состав гликокаликса входят периферические белки, выступающие наружу хвостовые участки мембранных гликолипидов и гликопротеинов, а также рабочие части интегральных белков. Морфологи-

129