до 30 мин, при 80° С — 10—15 мин. Иногда нагревают материал до 90° С и сразу же охлаждают. При таких способах обработки поги­бает большинство бесспоровых форм. Режим пастеризации опре­деляется устойчивостью материала к термической обработке, предполагаемой зараженностью его микроорганизмами и целью работы. Пастеризацию в лаборатории проводят в ультратермоста­те или на водяной бане. Ультратермостат представляет собой резервуар, заполненный водой, температура которой регулируется автоматически с помощью специального устройства (нагреватель-ный элемент, циркуляционный насос, контактный и контрольный термометры, блок управления, мотор и др.), укрепленного на верх­ней панели прибора. Сосуд с прогреваемым материалом закрыва­ют ватной пробкой. За температурой следят по термометру, поме­щенному в аналогичный сосуд с водой. Количество воды в этом сосуде должно быть равно количеству пастеризуемого материала.

В микробиологической практике пастеризацией сред или по­севного материала часто пользуются для выделения чистых куль­тур спорообразующих микроорганизмов и для выявления способ­ности микроорганизмов к образованию спор. Пастеризация широ­ко применяется в пищевой промышленности для обработки продук­тов, теряющих вкусовые и питательные качества при кипячении: молока, ягодных и фруктовых соков, вин, пива и др.

Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием применяется в тех случаях, когда субстраты не выдерживают нагревания, в частности, для сред, содержащих белки, для сывороток, некоторых антибиотиков, витаминов, летучих веществ, например, некоторых углеводородов. Этот прием довольно широко используется для стерилизации куль-туральной жидкости, когда необходимо освободить ее от клеток микроооганизмов, но сохранить все содержащиеся в ней продук­ты обмена в неизмененном виде. Способ заключается в фильтро­вании жидкостей через специальные фильтры, имеющие мелкопо­ристые перегородки и поэтому задерживающие клетки микроорга­низмов. Причем здесь имеет место не только механическая задерж­ка, но и адсорбция микроорганизмов па стенках (поверхностях), ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микро­организмов в водных суспензиях несет на своей поверхности отрицательным заряд, а фильтры изготавливаются из изложи-1ельно заряженных материалов. Если изготовить фильтр из элект­роотрицательного материала, например, из обожженного гипса пли алебастра, то многие микроорганизмы будут легко проходить через него. Поры фильтров должны быть достаточно мелкими не только затем, чтобы обеспечить механическую задержку клеток, но и для того, чтобы микроорганизмы оказались в сфере действии электрического заряда стенок. Диаметр пор определяет область

93

применения фильтров. Фильтры с относительно крупными порам: применяют для очистки (фильтрования) воды от планктонных организмов, для отделения более крупных микроорганизмов от мелких. Чем мельче поры фильтра, тем более пригоден он для стерилизации. Пригодность фильтров для стерилизации испыты­вают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например, Pseudomonas pyocyaneum; Serratia marcescens. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высевают на питательную среду. Если в те­чение пяти дней тест-организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Как правило, бактериальные фильтры пропускают вирусы и бактериофаги.

Бактериальные фильтры изготавливаются из различных мате­риалов. Они имеют различную форму и разный диаметр пор. обычно указанный на упаковке фильтра или в прилагаемом пас­порте. Нередко фильтры выпускаются под определенными номера­ми и марками. Каждый номер или марка соответствуют определен­ному размеру пор. В настоящее время для стерилизации наиболее широко используются два типа фильтров: мембранные фильтры и фильтры Зейтца.

Мембранные фильтры готовят из коллодия, ацетата, целлюло­зы и других материалов. Они представляют собой диски, напоми­нающие бумажные, толщиной около 0,1 мм. Диаметр мембранных фильтров может быть разный. Отечественная промышленность выпускает мембранные фильтры диаметром 35 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются № 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 5).

Для стерилизации наиболее пригоден фильтр № 1. Кроме пе­речисленных, выпускается еще так называемый «предваритель­ный фильтр». Он предназначен только для фильтрации.

Фильтры Зейтца — это плот­ные диски, изготовленные из сме­си асбеста с целлюлозой. С увели­чением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает. Верхняя поверхность дисков фло-кулирована. Отечественные асбес-

товые фильтры обозначаются марками Ф₂ и СФ. Стерилизующими являются фильтры марки СФ. Помятые асбестовые пластинки, а также пластинки с надломами и трещинами для работы непри­годны.

Кроме того, для стерилизации применяются фильтры, изго­товленные из каолина с примесью кварцевого песка («свечи» Шам-берлана), из инфузорной земли («свечи» Беркефельда, рис. 50) и из других материалов. Свечи Шамберлана различаются по разме­рам пор и степени пористости. Фильтры с обозначением L наибо-

лее пористые. Они пропускают все бактерии. Свечи L,bis и L₂ за­держивают клетки только крупных бактерий. Свечи L₃ задержи­вают споры столбняка и палочку дифтерии. Затем в порядке умень­шения размеров пор свечи обозначаются от L5 до L13. Свечи, пред­назначенные, главным образом, для фильтрации воды, обознача­ются F и В, причем, по своей пористости свечи F соответствуют

L₅, а свечи В—L7. Форма свеч Шам-берлана может быть разной. Свечи Беркефельда имеют обозначения W, N и V, что соответствует диаметрам пор 3—4, 5—7 и 8—12 мк.

Работа с бактериальными фильтрами осуществляется следую­щим образом. Фильтр должен быть закреплен в специальном дер­жателе, который вставляется в приемник фильтрата. Обычно при­емником является колба Бунзена. Для мембранных фильтров имеются многочисленные держатели, приспособленные для фильт­рования различных объемов жидкостей. Есть, например, держа­тель, изготовленный целиком из стекла, в котором в качестве опоры фильтра используется крупнопористый стеклянный диск. Есть металлические держатели. Держатели для фильтров Зейтца изготавливают в большинстве случаев из нержавеющей стали. Асбестовая пластина крепко зажимается винтами между верхней (цилиндр без дна) и нижней (воронкообразный тубус) частями держателя (рис. 51). Опорой для асбестового диска служит сетка или пористая пластинка из нержавеющей стали. Трубка фильтра,

По которой стекает фильтрат, через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде на­зывают фильтром Зейтца. Свечи Шамберлана вставляют непо­средственно в резиновую пробку. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизо-ваны. Мембранные фильтры можно стерилизовать, поместив их в дистиллированную воду, автоклавированием при 1 атм 15 мин или длительным кипячением. Сосуд с фильтрами должен быть закрыт ватной пробкой. Держатель вместе с резиновой пробкой заворачи­вают в бумагу и автоклавируют при 1 атм 20—30 мин. Прибор со­бирают непосредственно перед работой. Стерилизация мембранных фильтров вместе с держателем не рекомендуется, так как может привести к их повреждению. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде. Но туго завинчивать винты держателя перед сте-рализацией не рекомендуется. Винты подтягивают только после изъятия прибора из автоклава. Свечи стерилизуют в автоклаве вместе с резиновой пробкой. Перед стерилизацией их заворачивают в бумагу и хранят в таком виде до употребления. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой. В отводную трубку, которая будет присоединена к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон, и в таком виде приемник стерилизуют. Через мелкопористые фильт­ры жидкости проходят медленно. Поэтому обычно фильтрование форсируют путем создания на фильтре перепада давления, дости­гаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Чаще применяют откачивание воздуха, хотя иногда первый способ более удобен, так как при этом исключается вспенивание жидкостей, содержащих белок. Непосредственно перед работой ватную пробку колбы Бунзена быстро заменяют держателем с фильтром, а отвод­ной конец колбы соединяют с предохранительной склянкой, нахо­дящейся перед насосом. Тампон из отводного конца не вынимают, чтобы сохранить стерильность приемника. Разливку профильтро­ванных сред производят в стерильных условиях в заранее просте-рилизованную посуду. Так же, как и при термической стерилиза­ции, разлитые среды 2—3 суток выдерживают при 30° С. Если в них обнаружится рост микроорганизмов, среды готовят заново.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразо­вое использование. Свечи после использования сначала промывают дистиллированной водой, просасывая ее в направлении, обратном фильтрованию. Затем фильтры заливают на ночь концентрирован­ной серной кислотой, содержащей небольшие количества нитрата натрья и хлорнокислого калия. На следующий день их многократ­но промывают дистиллированной водой, а затем кипятят в воде для удаления растворенного воздуха. Свечи не следует мыть сме­сью двухромовокислого калия с серной кислотой, так как хромат адсорбируется на фильтре, что может привести к повреждению фильтра и испортить фильтрат. Нельзя обрабатывать фильтры кон-

центрированными растворами щелочей, так как это может увели­чить размеры пор. Для очистки свеч от посторонних частиц органи­ческого происхождения их можно прокаливать в муфельной печи.

Следует учитывать, что состав жидкостей, прошедших через бактериальные фильтры, может меняться вследствие адсорбции на фильтрах ряда веществ, таких, например, как некоторые жирные кислоты, белки, полисахариды и др. В результате среды могут ока­заться непригодными для культивирования данных микроорганиз­мов. Возможность и степень адсорбции веществ на фильтре опре­деляется химической природой фильтра, размерами его пор, време­нем фильтрования.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ

Основным способом стерилизации стеклянной посуды является стерилизация горячим воздухом. Она осуществляется в сушильных шкафах при температуре 165—170° С в течение двух часов. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Сушильные шкафы (рис. 52) де­лают из термостойких материа­лов — обычно из металла и асбес­та. Внутри шкафа имеются одна-две полки, а наверху отверстие, в котором с помощью пробки укреп­ляют термометр. У стенки шкафа или вблизи греющей поверхности температура всегда значительно выше, чем внутри, поэтому ртут­ный шарик термометра должен находиться внутри шкафа на рас­стоянии 6—8 см от верхней стен­ки. Наверху имеется также отвер­стие для вентиляции, которое при стерилизации закрывают. У шка­фов с электрическим нагревом имеются регуляторы, обеспечи­вающие поддержание необходи­мой температуры.

Подготовка посуды к стерилизации. Посуда перед стерилизацией должна быть тща­тельно вымыта и завернута в бу­магу для сохранения стерильно-

сти после прогревания. Посуду развертывают непосредственно перед употреблением.

На рис. 53 показан процесс подготовки пипеток к стерилиза­ции. В концы пипеток, которые берутся в рот, вставляют ватные

4 Зак. 322 97

тампоны. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги, ши­риной 4—5 см. Обмотку начинают с конца, который опускают в среду. Постепенным движением бумаги по спирали оканчивают обмотку у того конца, который берется в рот. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов перед сте­рилизацией обычно заворачивают по нескольку штук вместе или помещают их в специальные металлические или картонные пена­лы. Каждую чашку Петри лучше завертывать отдельно; можно завертывать и вместе по 2—3 штуки. Шпатели также стерилизуют завернутыми в бумагу; каждый шпатель заворачивают отдельно. Колбы, пробирки и трубки Бурри закрывают ватными пробками. На пробки можно надеть бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли.

Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в су­шильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить некоторую циркуляцию воздуха и равномерный, надежный прогрев стерили­зующегося материала. Сушильный шкаф при стерилизации дол­жен быть закрыт. Если шкаф не снабжен терморегулятором, необ­ходимо все время следить за температурой, так как при пониже­нии ее не осуществится стерилизация, а при нагреве выше 175°С бумага и пробки начинают разрушаться. По окончании стерили­зации шкаф че открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 100—70°С, так как при резком охлаждении иногда нару­шается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться.

Посуду можно стерилизовать и в автоклаве.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И ПРИБОРОВ

Мелкие металлические инструменты (петли, иглы, пинцеты, ножницы) стерилизуют прокаливанием в пламени непосредствен­но перед использованием. На пламени кратковременно обжигают горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливе сред. В пламени погибают и клетки, и споры микроорганизмов.

Приборы для культивирования микроорганизмов, а также де­тали к этим приборам, резиновые пробки и шланги стерилизуют автоклавированием. Предметы, подлежащие стерилизации в авто­клаве, завертывают в бумагу.

Некоторые предметы (металлические инструменты, мембран­ные фильтры) иногда стерилизуют длительным кипячением в ди­стиллированной воде. Однако этим способом с целью стерилиза-ции в микробиологической практике пользуются редко в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обрабатывае­мый материал, а уменьшение времени кипячения может не обеспе­чить стерилизацию, так как споры некоторых микроорганизмов

99

сохраняют жизнеспособность даже после кипячения в течение не­скольких часов.

Предметы, изготовленные из термолабильных пластмасс, на­пример, центрифужные пробирки, стерилизуют ультрафиолетовы­ми лучами. Время облучения устанавливают экспериментально. Оно зависит от мощности используемой бактерицидной лампы и расстояния между лампой и объектом. После облучения предметы до использования следует хранить в стерильной посуде.

Стерилизацию предметов из термолабильных пластмасс мож­но производить и окисью этилена.

Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов обобщены в табл. 6.

87