Глава VI

Способы стерилизации питательных сред, посуды, инструментов, приборов

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В микробиоло­гии под стерилизацией понимают уничтожение живых микроорга­низмов. Микробиологи стерилизуют среды, посуду, инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах.

Существуют следующие способы стерилизации.

Термическая стерилизация:

прокаливание в пламени,

стерилизация горячим воздухом,

стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклави-рование),

дробная стерилизация (тиндализация). Холодная стерилизация: фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами.

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются особенностями материала, подлежащего

стерилизации, его физическими свойствами и химическим составом, целью исследования.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование)

Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Он основан на нагревании мате­риала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосфер-

Совместное действие высокой температуры и пара обеспечп-вает особую эффективность данного способа. При этом поги­бают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерили­зацию в автоклаве приводят, при различных режимах. Когда гово- рят о режиме стерилизации в единицах давления, имеют в виду именно дополнительное давление: стерилизация при 0,5; 1,0;-2,0 атм. В зарубежной литературе режим автоклавированйя ча­сто характеризуется температурой и временем.

Устройство автоклава. Условия повышенного давле­ния пара создают в специальных герметически закрывающихся тол­стостенных аппаратах — автоклавах. Автоклавы бывают различной конструкции (рис. 47), но принципиальное их устройство следующее (рис. 48). Это металлический двустенный котел, способный выдер­живать высокое давление. Внутренняя часть котла является сте-рплизацпонной камерой (1). В нее помещают стерилизуемый материал. Стерилизационная камера снабжена краном (2) для выхода воздуха, манометром (3) для определения давления пара и предохранительным клапаном (4) для выхода пара при повы­шении давления сверх необходимого и для предотвращения разры­ва автоклава. Пространство между стенками (5), называемое «рубашкой» или водопаровои камерой, заполняется через воронку (6) водой (лучше дистиллированной, чтобы не образовывалась накипь) до определенного уровня, который отмечен на специаль­ной водомерной трубке автоклава. Выше этого уровня воду нали­вать не следует, так как при бурном кипении вода может попасть в трубку, ведущую к манометру, и исказить его показания. В верхней части внутренней стенки «рубашки» имеются отверстия (7), через которые пар поступает в стерилизационную камеру. Паровой котел обычно бывает сверху покрыт кожухом, изготов­ленным из листового железа. Кожух предохраняет котел от меха­нических повреждений, а работающих около автоклава — от ОЖО­ГОВ. Для создания герметичнееги автоклав плотно закрывается массивной крышкой (8) с резиновой прокладкой.

88

ции. К работе допускаются только подготовленные лица. Периоди­ческий контроль за автоклавом осуществляет котлонадзор.

Подготовка сред к стерилизации. Среды, предна­значенные для стерилизации в автоклаве, наливают не выше чем на половину высоты сосуда. Сосуды со средами закрывают ват­ными пробками, которые предохраняют среду от заражения микро­флорой, находящейся в окружающем воздухе. Пробки должны быть достаточно плотными, с равномерным распределением воло-

кон ваты, так как через них проис­ходит газообмен культуры с окру­жающей средой. Однако надо пом­нить, что слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воз­духом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, окатывают валиком. Что­бы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонями или между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки должна быть около 4 см. Пробка должна входить

в пробирку на 1,5—2,0 см (рис. 49). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обертывать пробку чистой марлевой салфеткой. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном или дру­гими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не на­греются до нужной температуры и не простерилизуются.

Автоклавирование. Стерилизация в автоклаве осущест­вляется следующим образом. В водопаровую камеру наливают воду. В стерилизационную камеру на специальную решетку (9) помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагреются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. Загрузив стерилизационную камеру, устанавливают и завинчивают крышку автоклава. Затем откры­вают кран (2), соединяющий камеру с наружным воздухом, и начинают нагревать автоклав. Нагревание автоклава производит­ся обычно электричеством или газом. На кран (2) надевают рези­новую трубку, которую опускают в ведро с водой. Отмечают вре­мя, когда из автоклава через кран начнет выходить пар. Пар вытесняет воздух, находящийся в автоклаве. Необходимо, чтобы из автоклава был удален весь воздух, так как губительное дейст­вие насыщенного перегретого пара на бактерии значительно сильнее, чем его смеси с воздухом. Это связано с тем, что при одном и том же давлении температура чистого пара выше темпе-

ратуры смеси пара и воздуха. В первые минуты вместе с паром в воду выходят большие пузыри воздуха с мягким булькающим звуком. Затем струя пара становится сильнее, но пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, проходя через воду, издает сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипя­щим звуком. Обычно пар выпускают в течение 15—20 мин, но не более, иначе в автоклаве останется мало воды, и он может испор­титься. Затем кран (2) закрывают и по манометру следят за повы­шением давления пара. На манометре обозначается то дополни­тельное давление, которое создается в автоклаве сверх нормаль­ного, т. е. сверх одной атмосферы. Когда стрелка манометра дойдет до указателя необходимого деления, и, следовательно, температура пара достигнет соответствующего значения, регули­руя нагрев, поддерживают давление на этом уровне необходимое время. Имеются автоклавы и с автоматическим регулированием режима. Когда истечет время стерилизации, нагревание автоклава прекращают. Давление в автоклаве падает. Необходимо дождать­ся, чтобы стрелка манометра упала до 0, т. е. давление пара в автоклаве сравнялось с атмосферным. Лишь после этого откры­вают кран (2), выводящий пар. Преждевременное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком сниже­нии давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки. Это нарушит впоследствии стериль­ность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку автокла­ва и вынимают стерильный материал. После стерилизации среды для проверки стерильности выдерживают 2—3 суток в термостате при 30° С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Температура и длительность автоклавирования определяются составом питательной среды. Такие легко разрушающиеся субст­раты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (сусло пивное, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 20— 30 мин. Мясо-пептонные среды стерилизуют при 1,0 атм 20— 30 мин. Однако имеются субстраты, в которых могут быть спорыГ отличаюшиеся особой термостабильностью. При указанных режи­мах автоклавирования такие субстраты могут остаться нестериль­ными. Особенно трудно простерилизовать почву. Ее обычно стери­лизуют один раз при 1 атм 2 часа, или 2 дня подряд по часу при) том же давлении, а иногда — при 2 атм 2 часа.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать значе­ние рН среды. При кислой реакции среды многие вещества, входя­щие в ее состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже зна­чение рН среды, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем сильнее происходит гидролиз. В результате по­сле "стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если среда щелочная, то при стерилизации выпадают р. осадок солп железа, карамелизуются и становятся