38. Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам биалофос, глифосат, бромоксилин.

Применяются гербициды сплошного действия, уничтожающие сорняки и культурные растения. А-группа гербицидов – избирательного действия очень мала (газон, одуванчик). Пр.: Раундап. Трансгены, устойчивые к гербицидам получают вводя гены бактериального или растительного происх-я. Из сорняков выделен ген рвсА, при его введении получают устойчивость к атразину. Из клетки Е.coli получен ген аroА, к гербициду Раундап (глифосат. к-та).

Roundup Ready (RR) растения в большинстве случаев содержат полную копию гена енолпирувилшикиматфосфат синтетазы (EPSPS или EPSP synthase) из почвенной бактерии Agrobacterium sp. strain CP4, но иногда и мутантные копии из других растений. RR-рапс (canola) содержит ген глифосат-оксидазы, которая разрушает активное начало гербицида Roundup.

Перспективно введение генов кодирующих ферменты, которые разрушают определенный гербицид. Пр.: ген синтеза монооксигеназы разрушает гербицид 2,4Д. А ферм. нитрилаза разрушает гербицид брокксилин.

Площадь трансгенов (в мире) устойчивых к гербицидам = 40 млн. га (примерно 50% посевов трансгенов).

Получение: культуру Е.coli, дрожжей обрабатывают глифосатом (Торнадо, Ураган, Баста) – губят растения. Бактерии погибнут. Некоторые выживут, т.к. в плазмидах синтезируют ген кодирующий синтез ферм. разруш-го глифосат. Кл. размножаются, выделяют этот ген. Его вшивают в вектор трансформации (Ти-плазмиду). Получают трансгенные раст. кл., затем целые растения. Для однодольных раст. прим. – биобаллистику (напыливают).

39. Перенос генов и их трансформация (векторы).

Перенос генов в кл. и их трансформация (встраивание в геном), осуществляется специф. стр-ми – вектороми. Виды векторов:

1) Биологическая баллистика (для однодольных). Используют суспензионную культуру кл. растения, каллусную ткань, или 5-дневные зародыши, на мельчайчие частицы – Au, вольфрам. Напыление ДНК и бомбардировка из биопушки за счет перепада давления, 10-15% выживут и трансформируются.

Генная пушка. В 1988 г. был предложен другой метод, пригодный для генетической трансформации большинства организмов, включая растения. Он основывается на механическом переносе ДНК сорбированной на микрочастицах твёрдого вещества (изначально золота), которые разгоняются до высоких скоростей с помощью генной пушки (Gene Gun) и выстреливаются в ткани трансформируемого организма. Попадая в клетки, чужеродная ДНК встраивается в хромосомы случайным образом и также наследуется по законам классической генетики. Этим методом удобно трансформировать растения, которые плохо поддаются агробактериальной трансформации. Например, RR-соя.

2) Метод прямого переноса генов в раст.: а) трансформация раст. протопластов и их слияние. б) микроиньекция ДНК (эфф-ть 10-20%). в) электропорация – ДНК проникает через поры в мембране под действ. импульсов высокого напряжения (эл. тока). г) упаковка в липосомы. Специфические тельца, оболочка из фосфолипидов, которые защищают ДНК от разрушения нуклеазами раст. кл.

3) Вектор на основе Ти-плазмиды Agrobacterium tumifaciens.

4) Бинарный и промежуточный векторы. Сконструированы на основе Ти-плазмиды. Из нее с помощью рестриктаз вырезают Т-области и вставляют ее в вектор для клонирования в кл. Е.coli. Е.coli размножают. Внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную рекомбинантную плазмиду Е.coli вводят в агробактерию, несущую полную Ти-плазмиду. В рез-те 2-го кроссинговера Т-область рекомбинацией плазмиды включается в Ти-плазмиду. Испол-ся для передачи гена растению.

Бинарный – агробактерии содержащие 2 разные Ти-плазмиды: 1 – несет Вир-область и обесп. интегрирование в геном раст. кл. Т-области с любыми генами другой Ти-плазмиды.

5) Векторы на основе ДНК вирусов раст. ДНК содерж. вирусы поражающие растения. Таких вирусов 1,5-2%. Берут вирус полосатости кукурузы или вирус мозайки цветной капусты. Имеют одноцепочечную НК. В кл. образуется 10 в 6 степень копий вируса и много НК. У них малый геном и сильный промотр, что обесп. эффективную экспрессию чужеродных генов (но они патогенны). Вирусы не встраиваются в геном растения. Их можно ликвидировать агроинфекцией, а ввести в кл. Ти-плазмиды.