6.3 Візуальний аналіз
Метод визначення вмісту нітратів у продуктах та ґрунтах базується на здатності нітрат аніонів реагувати з дифеніламіном в кислому середовищі з утворенням сполуки синього кольору. В разі наявності в зразках нітритів визначається сума нітрат та нітрит аніонів.
Матеріали та обладнання:
Стандартний розчин нітрат-аніону, 0,1 мг/см3;
Дифеніламін, 1%-вий розчин у концентрованій сульфатній кислоті;
Предметні скельця, пробірки з рискою (градуйовані), піпетки;
Порядок виконання аналізу:
Для побудови шкали візуального порівняння в п’ять пробірок додати стандартний розчин нітрат-аніону в кількості (мг): 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 відповідно, 1 см3 розчину дифеніламіну та довести дистильованою водою до мітки.
При визначенні нітратів у овочах та фруктах на аналіз беруть соковиту м’якоть, або сік. Кілька краплин соку (водної витяжки) перенести у пробірку (на предметне скло), додати 2-3 краплі розчину дифеніламіну та довести до риски дистильованою водою (на склі просто перемішати скляною паличкою). Забарвлення порівняти з раніше приготовленою стандартною шкалою. При використанні пробірок, досліджуваний розчин порівнюють зі шкалою у відбитому та наскрізному світлі.
При аналізі ґрунтів досліджуваний зразок розтерти в фарфоровій ступці і просіяти крізь сито з отворами діаметром 1мм. Наважку ґрунту 10 г помістити в колбу ємністю 100 см3, додати 50 см3 1 М розчину сульфатної кислоти і перемішувати протягом 3 хвилин. Після чого суміш відфільтрувати через подвійний складчастий фільтр (синя стрічка). Якщо фільтрат мутний, то слід повторити фільтрування. Отриманий розчин аналізують на вміст нітратів аналогічно описаній вище методиці.
Даний метод дозволяє визначити нітрат-аніони з точністю ±2%
6.5 Мікроскопія
Мікроскоп — оптичний прилад, призначений для розгляду об’єктів, невидимих неозброєним оком.
6.5.1 Будова різних видів мікроскопів
Мікроскоп МБР-1 (МБІ-1, «Біолам»)
Мікроскоп має оптичну і механічну частини (рисунок 6.2).
До механічної частини відносяться: штатив, предметний столик, тубус, револьвер, макро- і мікрометричні гвинти.
Штатив складається з масивної підковоподібної основи, що надає мікроскопу необхідної стійкості.
Від середини основи вгору відходить тубусотримач, зігнутий майже під прямим кутом, до нього прикріплений тубус, розташований похило.
На штативі укріплений предметний столик з круглим отвором в центрі. На столик поміщають предмет, що вивчається (звідси назва «предметний»). Через отвір всередині столика проходить пучок світла, який дозволяє розглядати об'єкт. На бічних сторонах штатива нижче предметного столика знаходяться два гвинти, що служать для пересування тубуса. Макрометричний гвинт, або кремальєра, має великий диск і при обертанні піднімає або опускає тубус для орієнтовного наведення на фокус. Макрометричний гвинт застосовують при малому (слабкому) збільшенні, при цьому об'єкт вивчають в одній площині. Мікрометричний гвинт, що має зовнішній диск меншого діаметру, при обертанні переміщає тубус незначно і служить для точного наведення на фокус. Мікрометричний гвинт використовують при роботі з великим (сильним) збільшенням, що дозволяє розглядати деталі і частини об'єкта, що знаходяться на різній глибині. Мікрометричним гвинтом користуються тоді, коли за допомогою макрогвинта об'єкт поставлений точно у фокус. Обертати мікрометричний гвинт можна лише напівоберта в обидві сторони. Завдяки різним розмірам знайти потрібний гвинт можна на дотик. Мікрометричний гвинт може мати вигляд плоскої пластинки, розташованої на підставці мікроскопа.
1 – основа (штатив); 2 – тубусотримач; 3 – тубус; 4 – предметний столик; 5 – отвір предметного столика; 6 – гвинти, що переміщають столик; 7 – окуляр; 8 – револьвер; 9 – об'єктив; 10 – макрометричний гвинт; 11– мікрометричний гвинт; 12 – конденсор; 13 – гвинт конденсора; 14 – діафрагма; 15 – дзеркало.
Рисунок 6.2 – Мікроскоп МБР-1
Оптична частина мікроскопа представлена окуляром і об'єктивами.
Окуляр (лат. ocullus — око) знаходиться у верхній частині тубуса і звернений до ока. Окуляр є системою лінз, поміщених в металеву гільзу циліндричної форми. Цифра на верхній поверхні окуляра означає кратність його збільшення (х7, х10, х15). Окуляр можна виймати з тубуса і при потребі замінювати іншим. На нижній частині тубуса знаходиться пластинка, яка обертається, або револьвер (лат, revolvo — кручу), що має три гнізда для об'єктивів. Як і окуляр, об'єктив є системою лінз, поміщених у загальну металеву оправу. Об'єктив угвинчується в гніздо револьвера. На бічній стороні об'єктиву цифрою позначена кратність збільшення. Розрізняють: об'єктив малого збільшення (х8), об'єктив великого збільшення (х40) та імерсійний об'єктив, який використовується для вивчення найдрібніших об'єктів (х90).
Загальне збільшення мікроскопа дорівнює збільшенню окуляра, помноженому на збільшення об'єктива.
Зображення в мікроскопі зворотне.
Освітлювальна частина мікроскопа складається з дзеркала, конденсора і діафрагми. Дзеркало укріплене рухливо на штативі нижче предметного столика, завдяки чому його можна обертати в будь-якому напрямі. Дзеркало встановлюють по відношенню до джерела світла так, щоб відбиті ним промені щонайкраще освітили поле зору мікроскопа. Пучок світла, що відбивається дзеркалом, проходить через отвір в центрі предметного столика і освітлює об'єкт. Дзеркало має дві поверхні — увігнуту і плоску. Увігнута поверхня краще концентрує світлові промені і тому використовується при слабшому освітленні (штучне світло).
Конденсор знаходиться між дзеркалом і предметним столиком. Він складається з двох-трьох лінз, поміщених в загальну оправу. Пучок світла, що відбивається дзеркалом, проходить через систему лінз конденсора. Міняючи положення конденсора (вище, нижче), можна змінювати інтенсивність освітленості об'єкту. Для переміщення конденсора використовують гвинт, що знаходиться попереду від мікро- і макрометричних гвинтів. При опусканні конденсора освітленість зменшується, при підніманні (до предметного столика) — збільшується.
Діафрагма, вмонтована в нижню частину конденсора, регулює освітлення. Діафрагма складається з пластинок, розташованих по кругу і частково перекриваючих одна одну таким чином, що в центрі залишається отвір для проходження світлового пучка. За допомогою спеціальної ручки, розташованої на конденсорі з правого боку, можна міняти положення пластинок діафрагми, зменшуючи або збільшуючи отвір. Максимально звужена діафрагма сприяє найбільшій чіткості зображення, що важливо при розгляді прозорих об'єктів.
Мікроскоп МБС-1
МБС-1 – стереоскопічний мікроскоп, що дозволяє отримати пряме і об'ємне зображення даного предмету. Використовується для препарувальних робіт і вивчення крупних об'єктів (рисунок 6.3).
Мікроскоп складається із столика, штатива, оптичної голівки і окулярної (бінокулярної) насадки.
Столик має вигляд круглого корпусу, що забезпечує стійкість мікроскопа. Всередині корпусу вмонтовано плоске дзеркало, одна сторона якого матова. На відміну від дзеркала мікроскопа МБР-1, воно може обертатися лише в горизонтальній площині. Спереду, напроти дзеркала, в стінці корпусу зроблений отвір, через який світло (денне або штучне) падає на дзеркало. Оскільки дзеркало обертається лише довкола горизонтальної осі, при штучному освітленні можна використовувати джерело розташоване безпосередньо перед вирізом корпусу, або спеціальний освітлювач (в умовах студентських лабораторій останні, як правило, не застосовуються). При роботі з штучним освітленням рекомендується використовувати матову поверхню дзеркала.
1– предметний столик; 2 – дзеркало; 3 – штатив; 4 – оптична голівка; 5 – бінокулярна насадка; 6 – окуляр; 7 – об'єктив; 8 – пристрій для регулювання міри збільшення; 9 – гвинт для насадки на фокус.
Рисунок 6.3 – Мікроскоп МБС-1
Штатив мікроскопа складається з плоскої підстави округлої форми, що є верхньою поверхнею столика, і масивного стрижня, вмонтованого в підставку, і несе на собі оптичну голівку. Спереду, над дзеркалом, підставка мікроскопа має отвір округлої форми, закритий скляною пластинкою.
Оптична голівка — основна частина мікроскопа. Корпус оптичної голівки має прямокутну форму. Верхня частина має різьбу для бінокулярної насадки, на нижній — укріплений об'єктив. На бічних сторонах оптичної голівки розташовані барабан, що обертається, (вперед) і гвинт (назад). Барабан — це частина пристрою для регулювання збільшення. Вісь барабана виведена на бічну стінку оптичної голівки. На ній є цифри 0,6; 1; 2; 4; 7, що позначають різну міру збільшення. Барабан можна закріплювати в будь-якому з п'яти положень, відповідних вказаним цифрам.
При обертанні, коли барабан займає будь-яке з вказаних положень, чується легке клацання і відбувається його фіксація. Гвинт, що знаходиться на бічній стороні оптичної голівки позаду барабана, служить для переміщення голівки вгору або вниз по стрижню, тобто для орієнтовного наведення на фокус.
На верхній поверхні оптичної голівки укріплена окулярна (бінокулярна) насадка. Вона складається з двох циліндричних трубок, в які вставлені окуляр і об'єктиви. Відстань між окуляром можна змінювати, розсовуючи або зближуючи їх руками, що дозволяє об'єднати два зображення в одне.
6.5.2 Техніка мікроскопування
Правила роботи з мікроскопом МБР-1
При перенесенні мікроскоп слід брати правою рукою за ручку штатива і підтримувати його знизу лівою рукою.
1. Установіть мікроскоп так, щоб його дзеркало знаходилося навпроти джерела світла.
2. Поставте у робоче положення об'єктив малого збільшення. Для цього повертайте револьвер до тих пір, поки потрібний об'єктив не займе серединне положення по відношенню до тубуса і предметного столика (стане над отвором столика). Коли об'єктив займає серединне (центроване) положення, в револьвері спрацьовує пристрій — клямка; при цьому чується легке клацання, і револьвер фіксується.
Запам'ятаєте, що вивчення будь-якого об'єкту починається з малого збільшення.
3. За допомогою макрометричного гвинта підніміть об'єктив над столиком на висоту приблизно 0,5 см. Відкрийте діафрагму і трохи підведіть конденсор.
4. Дивлячись в окуляр (лівим оком), обертайте дзеркало у різних напрямах до тих пір, поки поле зору не буде освітлено яскраво і рівномірно.
5. Покладіть на предметний столик приготовлений препарат покривним склом вгору, щоб об'єкт знаходився в центрі отвору предметного столика.
6. Повільно опустіть тубус за допомогою макрометричного гвинта, щоб об'єктив знаходився на відстані близько 2 мм від препарату.
7. Дивіться в окуляр і одночасно повільно піднімайте тубус за допомогою макрометричного гвинта до тих пір, поки в полі зору не з'явиться зображення об'єкту (фокусна відстань для малого збільшення рівна приблизно 0,5 см).
8. Щоб перейти до розгляду об'єкту при великому збільшенні мікроскопа, необхідно центрувати препарат, тобто помістити об'єкт або ту частину його, яку ви розглядаєте, в самий центр поля зору, дивлячись в окуляр, поки об'єкт не займе потрібного положення. Якщо об'єкт не буде центрований, то при великому збільшенні він залишиться поза увагою.
9. Повертаючи револьвер, поставте над препаратом об'єктив великого збільшення. При цьому чується клацання, і револьвер фіксується.
10. Для тонкого фокусування використовуйте мікрометричний гвинт.
11. При зарисовці препарату дивіться в окуляр лівим оком, а в альбом — правим.
При вивченні в світловому мікроскопі дрібних об'єктів використовують імерсійний (лат. immersia — занурювати) об'єктив. При роботі з цим об'єктивом на покривне скло необхідно помістити краплю речовини, що має показник заломлення, однаковий зі склом. Зазвичай для цього використовують кедрове масло. Між лінзою і покривним склом не залишається повітряного прошарку, і промінь світла проходить через однорідне відносно показника заломлення середовище без відхилення. При роботі з імерсійним об'єктивом
пп. 8 і 9 залишаються в силі.
12. Опустіть тубус (дивлячись на нього збоку) так, щоб нижня лінза об'єктиву занурилася в краплю імерсійного масла.
13. Дивлячись в окуляр, з допомогою лише мікрогвинта необхідно обережно (фокусна відстань для об'єктива х90 ще менша, ніж для об'єктива х40) небагато опустити, а потім підняти об'єктив, щоб отримати чітке зображення.
Пам'ятайте, що робота з імерсійним об'єктивом вимагає інтенсивнішого освітлення поля зору.
Правила роботи з мікроскопом МБС-1
1. Установіть мікроскоп штативом до себе і розташуйте так, щоб світло від настільної лампи падало через виріз в корпусі столика на дзеркало.
2. Дивлячись в окуляр і обертаючи дзеркало, добийтеся інтенсивного і рівномірного освітлення поля зору.
3. Помістіть на скляну пластинку підставки мікроскопа постійний мікропрепарат.
4.Установіть барабан в положення, відповідне цифрі 1, і, опускаючи або піднімаючи оптичну голівку за допомогою гвинта, отримаєте зображення об'єкта.
5. Зближуючи або розсовуючи руками окулярні трубки, добийтеся, щоб два зображення злилися в одне.
6. При налаштуванні мікроскопа необхідно стежити, щоб вісь голівки мікроскопа збігалася з центром скляної пластинки, інакше може спостерігатися нерівномірне освітлення поля зору.
При роботі з мікроскопом потрібно поводитись обережно . Так, при перенесенні мікроскопа можна брати його тільки за штатив, не можна без потреби виймати окуляр, крутити мікрометричний гвинт і т.д. Протирати окуляр потрібно тільки м’якою ганчіркою, призначеною спеціально для цього.
Збільшення мікроскопа оцінюється співвідношенням між лінійними розмірами створюваного ним зображення об’єкта і самого об’єкта. Воно розраховується як добуток збільшень об’єктива і окуляра. Загальне збільшення світлооптичного мікроскопа дорівнює 2000÷2500, однак корисне збільшення (що дозволяє виявляти деталі об’єкта) становить до 1500 разів.
6.5.3 Спеціальні методи світлової мікроскопії
Темнополъова мікроскопія (мікроскопія в темному полі) ґрунтується на використанні спеціального конденсора, який забезпечує освітлення препарату косими променями, що не попадають в об’єктив. За відсутності об’єктів поле зору являється темним. При їх наявності частина світла відображається ними в об’єктив, в результаті чого їх зображення з’являється в окулярі. Метод дозволяє виявити структури, розміри яких перевищують межі видимості світлового мікроскопа. Він може використовуватися для вивчення живих клітин.
Фазово-контрастна мікроскопія заснована на неоднаковій зміні фази світлових променів при їх проходженні через різні структури об'єкту, що вивчається. Фазово-контрастний мікроскоп перетворить непомітні для людського ока фазові відмінності в амплітудні. Цей метод дає можливість безпосереднього вивчення живих клітин без їх фіксації і фарбування.
Поляризаційна мікроскопія використовується для вивчення структур, що володіють властивостями анізотропії або подвійного променезаломлення. У поляризаційному мікроскопі на об'єкт прямує поляризований пучок світла, який надалі пропускається через аналізатор (розташований між об'єктивом і окуляром) — пристрій, що визначає відхилення площини поляризації світла унаслідок його проходження через об'єкт. Тим самим виявляється закономірне просторове розміщення молекул в об'єкті.
Ультрафіолетова мікроскопія пов'язана з освітленням об'єкту, що вивчається, ультрафіолетовими променями, котрі вибірково поглинаються його структурними компонентами. Завдяки тому, що ультрафіолетові промені мають коротшу довжину хвилі в порівнянні з променями видимої частини спектру, що збільшувальна здатність мікроскопа підвищується приблизно удвічі. Невидиме зображення в ультрафіолетовому мікроскопі перетвориться у видиме за допомогою люмінесцентного екрану або інших пристроїв.
Флуоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія використовує здатність деяких речовин випромінювати видиме світло при освітленні об'єкту ультрафіолетовими променями (аутофлуоресценція). В деяких випадках (наприклад, при виявленні катехоламінів методом Фалька) флюоресценція виникає після попередньої хімічної обробки тканини. Застосовують також флуоресцентні барвники (флуорехроми), що зв'язуються з різними структурами або речовинами в клітинах і міжклітинній речовині. Так, акридіновий помаранчевий, зв'язуючись з ДНК, дає свічення жовто-зеленого кольору, а з РНК — червоно-помаранчевого. Флуоресцентні барбники зв'язують (кон’югують) із специфічними антитілами для виявлення відповідних антигенів в тканинах імуно-гістохімічними методами.
6.5.4 Електронна мікроскопія
В даний час в наукових дослідженнях і клінічній діагностиці широке застосування знайшли два методи електронної мікроскопії – трансмісійна (просвічуюча) електронна мікроскопія і скануюча (растрова) електронна мікроскопія, що використовують відповідні мікроскопи, – ТЕМ (ПЕМ) і СЕМ (РЕМ).
Трансмісійна (просвічуюча) електронна мікроскопія заснована на використанні пучка електронів, що випромінюється електронною гарматою усередині колони мікроскопа в умовах високої прискорюючої напруги (40-100 кВ) і глибокого вакууму (10-4 мм рт. ст.). Фокусування пучка здійснюється електромагнітними лінзами, що виконують роль конденсатора, об'єктиву і проектора. Після проходження через об'єкт, що вивчається, поміщений в колону, який характеризується в різних своїх ділянках нерівномірною електронною густиною, пучок електронів прямує на флуоресцентний екран і створює площинне зображення об'єкту, яке фотографується на пластинку або плівку (рисунок 6.4).
ТЕМ дає можливість вивчення об'єктів, розміри яких лежать як в межах збільшення світлового мікроскопа, так і далеко за ними (аж до рівня макромолекул). Його збільшення теоретично досягає 0,002 нм, проте практично складає 0,2÷0,5 нм, а для більшості біологічних об'єктів — 1÷2 нм. Збільшення ТЕМ становить 100-1500 тис. разів.
Високовольтний ТЕМ (з прискорюючою напругою до 1000 кВ) забезпечує вищу швидкість руху електронів, які глибше проникають в об'єкт. Цей мікроскоп дає дуже велике збільшення і дозволяє використовувати товстіші зрізи (до декількох мікрометрів).
Пучок електронів випромінюється електронною гарматою (ЕП), що включає катод (КА) і анод (А), фокусується електромагнітними лінзами конденсора (КР), об'єктиву (О) і проектора (ПРО). Після проходження через об'єкт (ІО), що вивчається, пучок електронів направляється на флуоресцентний екран (ФЕ), створюючи зображення об'єкту, яке реєструється на фотопластинці або фотоплівці (ФП)
Рисунок 6.4 – Схема пристрою трансмісійного електронного мікроскопа
6.5.5 Приготування препаратів для мікроскопування
Препарати для мікроскопування готують з біологічних рідин, колоній бактерій, тканин тварин і рослин, кристалів солей та ін. В деяких випадках приготування препаратів нескладне, в інших — вимагає спеціальної техніки.
Найпростіше готують так звані нативні препарати, тобто об'єкти в природному їх вигляді. В цьому випадку матеріал наносять на предметне скло і покривають тонким покривним склом. Інколи його змішують з ізотонічним розчином хлориду натрію або гліцерином для розрідження, освітлення і оберігання від висихання. Так готують препарати для мікроскопічного дослідження біологічних рідин, одноклітинних мікроорганізмів.
Широко поширений метод забарвлення препаратів для мікроскопування. Спосіб забарвлення залежить від особливостей досліджуваного матеріалу і мети дослідження.
Різні частини препарату сприймають фарбу по-різному, що робить їх чіткішими, дозволяє відрізнити одну від одної окремі структури. Наприклад, мазки крові забарвлюються азуроеозином для підрахунку лейкоцитарної формули, фуксином - для підрахунку тромбоцитів, азуром II – для підрахунку ретикулоцитів.
Для бактеріоскопії – випромінювання під мікроскопом мікроорганізмів – існує велика кількість методів забарвлення, у тому числі і складних – двома і більшою кількістю барвників.
Існує негативний метод забарвлення, тобто зафарбовується фон препарату, на якому виразно видно незабарвлені мікроорганізми, наприклад бліда трепонема.
Препарат для мікроскопії не може бути товстим або густим, оскільки світло повинно добре проходити крізь нього, тому приготування гістологічних препаратів з тканин вимагає досить складної техніки. Тканину обробляють спиртами, формаліном або фіксуючими сумішами, просочують целоїдином, парафіном або желатином. Потім отримують якнайтонші зрізи тканини за допомогою спеціального приладу – мікротому. Після цього зрізи забарвлюють гематоксилін-еозіном, суданом, складними сумішами барвників, сріблом і так далі. Зрізи закріплюють на предметному склі сумішшю білка з гліцерином. Для збереження препаратів зрізи заливають канадським бальзамом і накривають покривним склом. Бальзам засихає і гістологічний препарат може зберігатися на протязі багатьох років.