19. Методы микробиологической диагностики туберкулеза. Использование экспресс-методов и аллергологического метода.

Микробиологическая диагностика. Микро­биологическая диагностика является логичес­ким завершением всех мероприятий по выяв­лению больных туберкулезом. Материалом для исследования служат мокрота, промывные во­ды бронхов и промывные воды желудка, плев­ральная и цереброспинальная жидкости, моча, менструальная кровь, асцитическая жидкость, а также кусочки тканей и органов, взятые на исследование во время операции или биопсии. Чаще всего исследуют мокроту.

Основными или обязательными методами микробиологической диагностики туберкулеза являются бактериоскопическое и бактерио­логическое исследование, биологическая проба, а также туберкулинодиагностика в виде внутрикожного теста с 2ТЕ очищенного туберку­лина в стандартном разведении или в виде градуированной кожной пробы с различны­ми разведениями туберкулина. Обнаружение в патологическом материале возбудителей туберкулеза является прямым доказательством активности инфекционного процесса.

Бактериоскопическое исследование заключа­ется в многократном проведении прямой мик­роскопии мазков из исследуемого материала, окрашенных по Цилю—Нельсену. В препара­тах можно обнаружить единичные микроор­ганизмы, если в 1 мл мокроты их содержится не менее 10000—100000 бактериальных клеток (предел метода). Метод прямой микроскопии прост, экономичен. Он должен применяться во всех клинико-диагностических лаборато­риях обшей лечебной сети при обследова­нии лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 недель, боли в грудной клетке, кро­вохарканье, потеря массы тела), лиц, кон­тактировавших с бациллярными больными туберкулезом, и лиц, имеющих рентгенологи­ческие изменения в легких, подозрительные на туберкулез. При получении отрицательных результатов прибегают к методам обогащения материала: флотации и гомогенизации (седи­ментации). Чаще применяют метод флотации. Для этого мокроту гомогенизируют, затем до­бавляют углевод (ксилол, толуол или бензин) и встряхивают в течение 10—15 мин. Добавляют дистиллированную воду и оставляют стоять на 2 ч при комнатной температуре. Капельки углевода адсорбируют микобактерии и всплы­вают, образуя кольцо на поверхности. Кольцо снимают и готовят микропрепараты, окра­шенные по Цилю—Нельсену. Широкое рас­пространение получил высокочувствительный метод люминесцентной микроскопии, основан­ный на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и светиться при облучении ультрафиолетовы­ми лучами. Так как бактериоскопическое ис­следование не позволяет определить видовую принадлежность микобактерий, оно относит­ся к ориентировочным методам диагностики и должно сочетаться с другими, основными методами исследования.

Бактериологическое исследование является более чувствительным, чем бактериоскопичес­кое, и позволяет выявить возбудителей тубер­кулеза при наличии в исследуемом материале всего нескольких десятков жизнеспособных микроорганизмов. Для повышения вероят­ности получения роста микобактерий реко­мендуется засевать исследуемый материал на

• 3 различные по составу питательные среды одновременно, а также многократность про­ведения исследования. Параллельно делают высевы на среды для выявления L-форм ми­кобактерий, а также сопутствующей микро­флоры. Помимо определения видовой при­надлежности выделенной чистой культуры микобактерий, обязательно определяют чувс­твительность микобактерий к антибиотикам. Для быстрого определения антибиотикорезис- тентности клинических изолятов применяют ПЦР. Недостатками бактериологического ме­тода исследования являются его трудоемкость и длительность; результаты исследования мож­но получить лишь через 5—6 недель.

В качестве ускоренных методов бактери­ологической диагностики, позволяющих со­кратить время выделения и идентификации возбудителей туберкулеза до 7-14 дней, при- итяют.метод микрокультур (метод Прайса), а также полностью автоматизированные ком­мерческие системы бульонного культивиро­вания ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВасТ.

Основным компонентом коммерческой системы ВАСТЕС являются пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), которые кроме модифицированного бульона Миддлбрука 7Н9 содержат в придонной части под силико­ном флюоресцентный индикатор, «погашен­ный» высокими концентрациями 0₂. В процессе потребления растворенного в среде 0₂ растущи­ми клетками индикатор начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Интенсивность свечения оценивается автоматически.

Другая автоматизированная система — МВ/ ВасТ использует для определения наличия микобактерий технологию колориметричес­кого детектирования С0₂, образующегося в ходе метаболизма, в уникальных флаконах, содержащих сенсор, изменение цвета которо­го регистрируется компьютером, осуществля­ющим анализ и интерпретацию данных.

Данные способы детекции предназначены как для ускоренной бактериологической диа­гностики, так и для определения антибиотикочувствительности.

Наиболее чувствительным методом выявления возбудителей туберкулеза является постановка биологической пробы, позволяющая обнаружить от 1 до 5 микробных клеток в исследуемом мате­риале. Метод имеет большое значение при ис­следовании одноразового материала (кусочки тканей и органов, взятые во время операции, биопсийный материал), а также при получе­нии отрицательных результатов при использо­вании первых двух методов исследования. Он играет важную роль при выявлении морфова- ров возбудителей туберкулеза и является ос­новным дифференциально-диагностическим тестом при определении видовой принадлеж­ности и вирулентности патогенных и условно- патогенных микобактерий.

Туберкулинодиагностика основана на опреде­лении повышенной чувствительности макро­организма к туберкулину, наступившей вследс­твие заражения возбудителями туберкулеза или вакцинации BCG, с помощью кожных аллерги­ческих проб. В основе данных проб лежит разви­тие реакции гиперчувствительности 4 типа, что свидетельствует об инфицировании.

Туберкулин — это общее название препаратов, полученных из микобактерий человеческого или бычьего типов, вакцинного штамма BCG, также М. avium. К ним относятся: старый туберкулин Коха — ATK (Alt Tuberculin Koch); сухой очищенный туберкулин — PPD (Purified Protein Derivative); очищенный туберкулин в стандартном разведении, разработанный М. А. Линниковой, — PPD-L, содержащий в 0,1 мл одну дозу, равную 2, 5, 10 и 100ТЕ.

При проведении массового обследования населения с целью своевременного выяв­ления первичного инфицирования детей и подростков, проявляющегося в вираже ту­беркулиновых проб, а также для выявления гиперергических реакций у детей, подрос­тков и взрослых, отбора для ревакцинации BCG неинфицированных лиц применяется внутрикожная проба Манту с 2ТЕ PPD-L. Это ведущий метод диагностики туберкуле­за у детей и подростков. Результаты пробы оцениваются через 48-72 ч. Реакция счи­тается положительной при наличии выра­женного инфильтрата (папулы) диаметром 5 мм и более (3 мм и более при безыгольном методе). Проба свидетельствует не о заболе­вании, а об инфицировании.

Интенсивность туберкулиновой реакции определяется степенью специфической сен­сибилизации организма, его реактивностью и многими другими факторами. У практически здоровых лиц, инфицированных возбудите­лями туберкулеза, туберкулиновые реакции обычно менее выражены, чем у больных с ак­тивными формами туберкулеза. Проба отрица­тельная у здоровых неинфицированных лиц, а также у больных ареактивной и промежуточ­ными формами туберкулеза. Если у взрослых положительная реакция свидетельствует об инфицировании вследствие предшествующе­го контакта с возбудителями туберкулеза, то у детей, ранее не реагировавших на туберкулин, появление положительной реакции (вираж туберкулиновых проб) указывает на недавнее заражение и служит показанием для прове­дения лечебных мероприятий. Для определе­ния активности инфекционного процесса в стационарах, в том числе перед проведением туберкулинотерапии, проводят более деталь­ную индивидуальную туберкулинодиагностику (проба Манту с различными дозами ту­беркулина, градуированная накожная проба, подкожная проба Коха). PPD применяют при изучении иммунного статуса in vitro в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и реакции торможения миграции лейкоцитов, а также при определении антител в РИГА с туберкулин-диагностикумом эритроцитарным туберкулезным антигенным сухим. Усиление реакции торможения миграции лейкоцитов совпадает с прогрессированием течения ту­беркулезного процесса, а усиление реакции РБТЛ, наоборот, с повышением защитных сил организма.

Для экспресс-диагностики туберкулеза при­меняют РИФ с использованием видоспецифи- ческих моноклональных антител, метод лазер­ной флюоресценции, микробиочипы, а также ПЦР, позволяющую сократить исследования до 2 суток.

Разработан ИФА, направленный на обна­ружение антител к возбудителям туберкуле­за в сыворотках крови, что свидетельству­ет об инфицировании, а не о заболевании. Метод может быть использован для массово­го исследования населения вместо реакции Манту. Наличие антител у больных говорит об активности процесса, поэтому в регионах с низкой заболеваемостью и инфицирован- ностью ИФА применяют в целях раннего выявления туберкулеза, особенно его внелегочных форм.

В целом же серологические реакции, на­правленные на обнаружение, как антигенов возбудителей туберкулеза, так и антител к антигенам (ИФА, РИА, РНИФ, РИГА, ла­текс-агглютинация, ТВ-Spot (тест-гребенка) и т. д.), а также определение иммунных ком­плексов в связи с низкой чувствительностью и специфичностью имеют второстепенное значение. Разработка методов иммунологи­ческой диагностики туберкулеза, в том числе и серологических методов, является одной из важнейших практических задач, так как туберкулиновые пробы в последние годы ста­новятся малопригодными в связи с широким инфицированием условно-патогенными ми- кобактериями, а также повсеместной вакци­нацией BCG и низкой специфичностью.