Экспериментальная часть

Установка для исследования обмена О₂ полярографическим методом включает в себя:

1) полярографическую ячейку с биологическим объектом;

2) магнитную мешалку ММ-3М;

3) ПКН - преобразователь код-напряжение;

4) ПНК - преобразователь напряжение-код;

5) управляющую ЭВМ.

Блок-схема установки для полярографического анализа веществ представлена на рис. 2.

Полярографическая ячейка интегрального типа (рис. 3), выполненная из органического стекла, состоит из рабочей камеры для объекта и электродной системы, которая одновременно является съемной крышкой рабочей камеры. Закрытая ячейка имеет объем 10 мл. Перемешивание раствора в этом объеме производится вертушкой (магнитом, запаянным в стекло), которая вращается магнитной мешалкой. Нижний штуцер рабочей камеры служит для введения в нее объекта и добавок. Верхний штуцер необходим для выхода газового потока при калибровке ячейки. Электродная система изолирована от раствора рабочей камеры полиэтиленовой мембраной (толщиной 5-10 мкм), которая фиксируется тефлоновым кольцом (диаметром 20 мм). Дисковый платиновый катод (диаметром 2 мм) расположен в центре электродной системы. Поверхность электрода полируется, что повышает чувствительность системы и улучшает воспроизводимость результатов. Спиральный хлорсеребряный анод (площадью 150 мм²) расположен в круговой выемке вокруг платинового катода. Свободное пространство под полиэтиленовой мембраной заполнено раствором 0.1 H KCl. Для подготовки полярографической ячейки к работе необходимо:

1) нанести на электродную площадку несколько капель 0.1 Н KСl; образовавшуюся каплю накрыть полиэтиленовой мембраной зафиксировать тефлоновым кольцом;

2) вставить электродную систему в рабочую камеру;

3) с помощью шприца заполнить ячейку аэрированным раствором фосфатного буфера (0.2 М, рН=7.0) или 0.1 Н раствором КСl;

4) установить ячейку на подставке магнитной мешалки ММ-3М;

5) штуцера от платинового и хлорсеребряного электродов подсоединить соответственно к входам “рабочий” и “вспомогат.”

5) включить магнитную мешалку ММ-3М.

ЗАДАНИЕ №1. Измерение полярограммы восстановления кислорода на платиновом катоде.

Для снятия полярограммы постоянного тока (классический режим) необходимо включить ЭВМ, войти в программу “полярограф” и включить режим измерений (нажатием клавиш F2 и Enter). На экране дисплея по оси ординат - ток (мкА), по оси абсцисс - напряжение (мВ).

От управляющей ЭВМ через преобразователь код-напряжение (ПКН) на ячейку подается линейно-изменяющееся напряжение (развертка) от 0 до -1 В со скоростью 2-5 мВ/с (рис. 2). Отрицательное напряжение соответствует катодной поляризации рабочего электрода. Для запуска развертки и записи полярограммы необходимо нажать клавишу Enter.

Отводимый от ячейки ток с помощью операционного усилителя преобразуется в выходное напряжение, поступает на вход преобразователя напряжение-код (ПНК) и далее на управляющую ЭВМ (рис. 2).

После записи полярограммы снова нажимаем клавишу Enter. На экране дисплея появляются 3 вертикальные линии. Эти линии смещаются вправо и влево при нажатии функциональных клавиш F1, F2 и F3, соответственно. Первые две линии выделяют участок кривой, на котором определяется остаточный ток, третья линия устанавливается в область плато полярограммы (-800 - -1000 мВ). Далее снова нажимаем Enter и на экране высвечиваются 2 параметра - предельный ток (мкА) и потенциал полуволны (мВ).

До выхода из программы можно вызвать любую кривую, нажав клавишу Tab и далее Enter. Чтобы выйти из режима просмотра, снова нажимаем Tab и можно делать новое измерение, нажав клавишу Enter. Esc - выход из программы.

В отчете: определить потенциал полуволны растворенного кислорода и концентрацию кислорода в растворе.

Следует иметь в виду, что растворимость О₂ в фосфатном буфере при 760 мм рт. ст. (в 1 мл раствора составляет):

t, 0C	мк моль О2
20	0.57
21	0.56
22	0.55
23	0.54
24	0.53
25	0.525

ЗАДАНИЕ №2. Определение скорости дыхания дрожжей.

Главным анализируемым параметром при изучении дыхания является скорость поглощения О₂, которая определяется как VО₂=tg= [O₂] t.

Для регистрации поглощения О₂ в процессе дыхания дрожжей необходимо:

1) взвесить 600-700 мг дрожжевой массы и рассуспендировать ее в 6-7 мл фосфатного буфера (0.2 М, рН=7.0);

2) в программе “полярограф” записать кривую изменения полярографического тока за 5 мин. (соответствующие установлению диффузионного равновесия между газовой фазой воздуха в рабочей камере ячейки и растворов в приэлектродном слое под мембраной);

3) ввести в ячейку через нижний штуцер шприцом 1 мл приготовленной суспензии дрожжей и записать изменение концентрации 0₂ за 5 мин.;

4) добавить в ячейку 1 мл субстрата дыхания - глюкозы (0.1 М раствор), записать изменение тока (i[0₂]) за 5 мин..

В отчете: дать расчет скорости дыхания дрожжей с субстратом и без.

ЗАДАНИЕ №3. Исследование действия ингибиторов дыхания и разобщителей фосфорилирования на скорость поглощения О₂.

При изучении механизмов дыхания ценную информацию дает анализ изменения скорости поглощения 0₂. В частности, тот факт, что некоторые вещества (2,4-динитрофенол, фенилгидразоны и др. ) в присутствие избытка субстрата стимулируют поглощение 0₂, но одновременно ингибируют синтез АТФ, послужил основой гипотезы о сопряжении процессов электронного транспорта и фосфорилирования. Соответствующие агенты называются разобщители фосфорилирования. С другой стороны, анализ эффектов различных классов ингибиторов дыхания (ротенон, амитал, антимицин А, KCN, СО и др.) позволяет вычленить отдельные участки и ферментные комплексы в их последовательности по дыхательной цепи.

1) выполнить пункты 2-4 задания 2;

2) добавить в ячейку 1 мл 2,4-динитрофенола (2*10^-4 М) и записать изменения [0₂] за 5 мин.;

3) добавить в ячейку 1 мл амитала (2*10^-2 М) и записать изменения тока за 5 мин.;

4) ввести в ячейку 1 мл субстрата дыхания сукцината (0.1 М), который дает электроны в дыхательную цепь в обход места ингибирования амитала. Записать изменения [0₂] за 5 мин..

В отчете: представить таблицу скоростей поглощения 0₂ при каждой добавке.

После окончания измерений выключить магнитную мешалку, выйти из программы (Esc), затем выключить ЭВМ (выключатель справа сбоку), вымыть ячейку.

Отчет о проделанной работе должен содержать:

1. Название и цель работы;

2. Список приборов и принадлежностей, необходимых для выполнения работы;

3. Краткое описание выполненной работы;

4. Полученные результаты.