Определение концентрации и скорости обмена кислорода
Одним из наиболее важных аспектов энергетики функционирования биологических систем, начиная от клетки и заканчивая биосферой в целом, является обмен кислорода. Два основных биологических процесса обмена О2 - фотосинтез и дыхание - в настоящее время изучаются с помощью чувствительного и быстрого полярографического метода.
Определение концентрации О2 в растворе по катодной полярографической волне восстановления молекул в двух возможных реакциях:
В зависимости от природы металла, состава раствора, состояния поверхности и потенциала электрода, механизм электрохимического восстановления может варьировать, но в любом случае суммарная реакция на электроде имеет вид:
О2 + 4Н+ + 4е 2 Н2О (в кислой среде)
О2 + 2 Н2О ++ 4е 4 ОН- (в щелочной среде).
В качестве индикаторных электродов обычно используют платиновые микро- и макроэлектроды. Различие двух этих типов электродов заключается не столько в площади поверхности, сколько в принципе методики измерения обмена О2 у биообъектов.
Полярографические ячейки интегрального типа измерений обмена о2
Такие ячейки используются для определения средней [О2] в небольшом замкнутом объеме с биообъектом. Известно несколько модификаций конструкции электродных систем такого типа ячеек, но как правило в их основе лежит индикаторный платиновый электрод с малой поверхностью. Обязательное условие измерительной процедуры в интегральных ячейках - интенсивное перемешивание раствора, необходимое для ускорения установления диффузионного равновесия по О2 в системе [объект - рабочий объем раствора - электрод]. Кроме того, перемешивание резко повышает чувствительность некоторых разновидностей интегральных ячеек (с вращающимся или вибрирующим электродом), так как значительно уменьшает толщину приэлектродного диффузионного слоя и тем самым увеличивает диффузионный ток.
Достоинством интегральных полярографических ячеек является простота их калибровки в абсолютных единицах [О2], хорошая стабильность и воспроизводимость показаний, достаточно высокая чувствительность. Из недостатков необходимо отметить относительно узкий динамический диапазон возможных скоростей газообмена О2 объекта, т. к. в ограниченном замкнутом объеме нельзя сохранить стационарность параметров среды, которые необратимо изменяются объектом.
Полярографические ячейки дифференциального типа измерений обмена о2
Ячейки этого типа применяются в исследованиях быстрых изменений скорости обмена О2 у биообъектов (главным образом у фотосинтезирующих организмов). Величина тока для такой ячейки пропорциональна непосредственно скорости выделения или поглощения О2. В данном случае объект помещается непосредственно на поверхность большого платинового электрода, и поэтому все измерения тока в ячейке отражают изменения локальной концентрации О2 в пределах приэлектродного диффузионного слоя при практически неизменном содержании О2 в объеме. Повышенная стабилизация [О2] в этом внешнем по отношению к объекту резервуаре (объект удерживается на электроде микропористой целлофановой пленкой). Разность значений тока дифференциальной ячейки без объекта и с объектом прямо пропорциональна величине скорости обмена О2 у объектов под действием каких-либо факторов (например, зависимость фотосинтеза от интенсивности света).
Дифференциальные ячейки имеют ряд преимуществ по сравнению с интегральными. У них большая чувствительность (~10-16 моль 02 сек-1), меньшая инертность (~10-3 сек). С таким устройством легко осуществимы длительные эксперименты с одной пробой. Однако, калибровка в абсолютных единицах [О2] встречает методические трудности.
Наиболее распространенный вид электродов сравнения - хлорсеребряный. Он менее токсичен, чем каломельные электроды, т. к. постоянство его потенциала определяется реакцией обмена Cl- , последние должны присутствовать в растворе в количестве 10 - 100 мМ. Во многих случаях оба электрода, и платиновый, и хлорсеребряный, изолируются от объекта и раствора тонкой полимерной пленкой, которая непроницаема для высокомолекулярных соединений, ионов и Н2О, но хорошо пропускает О2. В этом случае подмембранное пространство заполняется 0.1 М КСl или 0.1 М КOH. Пленка защищает платиновый электрод от побочного влияния метаболитов объекта, повышая тем самым стабильность.