- •ПРЕДИСЛОВИЕ ПЕРЕВОДЧИКА
- •ПРЕДИСЛОВИЕ
- •СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- •1. Введение
- •1.1. Освещение по Кёлеру
- •1.1.1. Принципы метода
- •1.1.2. Предварительная проверка оборудования
- •1.2. Установка света по Кёлеру
- •2.1. Преломление
- •2.1.1. Числовая апертура
- •2.2. Отражение, поглощение и пропускание
- •2.3. Флуоресценция/фосфоресценция
- •2.4. Поляризация
- •2.5. Дифракция
- •2.5.1. Тестовые пластинки Аббе
- •2.5.2. Формирование первичного изображения
- •2.5.3. Разрешающая способность
- •2.5.4. Роль конденсора в разрешении микроскопа
- •2.5.5. Увеличение
- •2.5.6. Увеличение и разрешение
- •4. Поле зрения
- •5. Резюме
- •6. Литература для дальнейшего чтения
- •1. Введение
- •1.1. Определение контраста
- •2. Светлопольная микроскопия
- •3. Фазовый контраст
- •3.2. Дифрагированный свет в фазовом контрасте
- •4. Темнопольная микроскопия
- •4.1. Освещение по Рейнбергу
- •4.2. Темнопольные конденсоры высокого разрешения
- •4.3. Темнопольное изображение
- •5. Поляризованный свет
- •5.1. Использование одиночного поляризатора
- •5.2. Использование скрещенных поляризаторов
- •5.2.2. Направление двулучепреломления
- •6.3. Интерференционная отражательная микроскопия
- •6.3.2. Физические основы метода
- •6.3.3. Интерпретация результатов
- •7.1. Красители
- •7.2. Использование светофильтров
- •7.3. Срезы
- •7.4. Качество препарата
- •8. Другие методы
- •8.1. Дисперсионное окрашивание
- •10. Благодарности
- •11. Литература
- •ФИКСИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Рисование
- •3. Фотомикрография
- •4.1. Разрешение
- •4.2. Разрешающая способность и размер отпечатка
- •4.4. Освещение
- •5. Микроскоп для фотомикрографии
- •5.1. Штатив микроскопа
- •5.2. Оптика
- •5.2.1. Числовая апертура и увеличение объективов
- •5.2.2. Исправление аберраций
- •5.2.4. Иммерсионные объективы
- •5.2.5. Глубина резкости
- •5.2.6. Кривизна поля зрения
- •5.2.7. Типы конденсоров
- •5.2.8. Чистка линз
- •6. Камера для фотомикрографии
- •6.1. Выбор размера пленки
- •6.3. Специальная фотомикрографическая камера
- •6.4. Микроскопы со встроенными фотосистемами
- •6.5. Камера с мехами
- •7. Наведение на фокус и определение экспозиции
- •7.1. Наведение на фокус
- •7.2. Определение экспозиции
- •7.3. Контроль экспозиции
- •8. Выбор условий для фотомикрографии
- •8.1. Фотографический процесс
- •8.1.1. Чувствительность пленки
- •8.1.2. Зернистость
- •8.1.3. Контрастность
- •8.2. Черно-белая фотомикрография
- •8.3. Цветная фотомикрография
- •8.3.1. Цветные отпечатки или слайды
- •8.3.2. Печать со слайдов
- •8.3.3. Цветовая температура
- •8.3.4. Коррекция цветовых искажений
- •8.3.6. Выбор чувствительности пленки
- •8.4. Поляроидные клетки
- •8.4.2. Камера Поляроид SX70
- •8.4.3. Поляроидные слайды
- •8.5. Хранение неэкспонированной пленки
- •9. Фотомакрография
- •9.1.1. Стереомикроскопы для фотомикрографии
- •9.1.2. Макроскопы
- •9.1.3. Фотомакрографические объективы
- •9.2. Освещение для фотомакрографии
- •9.3. Определение экспозиции при фотомакрографии
- •10. Завершение процесса фотомикрографии
- •10.1. Содержание записей
- •10.2. Хранение негативов
- •10.3. Хранение слайдов
- •10.4. Монтаж слайдов
- •10.5. Хранение отпечатков
- •10.6. Определение и указание увеличения
- •11. Практическое руководство
- •11.2. Начальная калибровка экспонометра
- •12. Литература для дальнейшего чтения
- •ИММУНОГИСТОХИМИЯ
- •1. Введение
- •2. Антитела
- •2.1. Структура иммуноглобулинов
- •2.2. Поликлональная антисыворотка
- •2.3. Моноклональные антитела
- •2.4. Очистка антител
- •2.5. Специфичность реакций антител
- •2.6. Хранение антител
- •3.1. Выбор условий обработки ткани
- •3.2. Выявление скрытых антигенов
- •4. Выбор способа мечения
- •4.1. Флуоресцентные метки
- •4.2. Ферментные метки
- •4.2.1. Пероксидаза хрена
- •4.2.2. Щелочная фосфатаза
- •4.2.3. Глюкозооксидаза
- •4.2.4. Галактозидаза
- •4.3. Коллоидное золото
- •4.4. Выбор метки
- •5. Методы окраски
- •5.1. Прямой метод
- •5.2. Непрямой метод
- •5.4. Системы с использованием биотин — авидина
- •5.5. Другие методы
- •6. Экспериментальные методы
- •6.1. Общее описание метода
- •6.2. Выбор правильного разведения антител
- •6.3. Флуоресцентные метки
- •6.4. Пероксидаза
- •6.4.1. Ингибирование эндогенного фермента
- •6.5. Щелочная фосфатаза
- •6.5.1. Блокирование эндогенного фермента
- •6.5.2. Мера предосторожности
- •6.6. Глюкозооксидаза
- •6.7. Галактозидаза
- •6.9. Некоторые общие процедуры
- •6.9.1. Покрытие предметных стекол
- •6.9.2. Дополнительное окрашивание
- •7.1. Контрольные препараты
- •7.2. Решение проблем
- •9. ДНК-зонды для гибридизации in situ
- •9.1. Принцип метода гибридизации
- •9.2. Экспериментальная процедура
- •9.2.1. Выявление Y-хромосомы
- •9.2.2. Выявление цитомегаловируса
- •10. Цитологические препараты
- •11. Количественная оценка
- •12. Оборудование
- •13. Благодарности
- •14. Литература
- •ГИСТОХИМИЯ И СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •1.1. Объекты для гистохимического окрашивания
- •1.1.1. Что такое окрашивание?
- •2. Приготовление и хранение срезов препаратов
- •2.1. Необходимые характеристики препарата
- •2.2. Методы приготовления и хранения препаратов
- •2.2.1. Получение тонких слоев
- •3. Что можно выявлять? Некоторые примеры
- •3.1. Выявление химических свойств
- •3.1.1. Химические фрагменты
- •3.1.2. Специфические вещества
- •3.1.3. Классы веществ
- •3.2. Выявление биологических объектов
- •3.2.1. Биологические объекты
- •3.2.2. Биологические процессы
- •3.3. Морфологические исследования
- •4. Выбор методов
- •5.1. Оценка селективности методов
- •5.2. Оценка локализации окрашивания
- •5.4. Оценка чистоты реагентов
- •5.5. Номенклатура реагентов
- •6. Что необходимо для гистохимической работы
- •6.1. Оборудование и материалы
- •6.2. Как научиться работать?
- •7. Почему используются гистохимические методы
- •8. Благодарности
- •ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •2. Флуорохромы
- •3. Флуоресцентный микроскоп
- •3.1. Способы освещения
- •3.1.1. Освещение проходящим светом
- •3.1.2. Освещение падающим светом
- •3.2. Источники света
- •3.3. Домики для ламп
- •3.4. Фильтры
- •3.4.1. Возбуждающие фильтры
- •3.4.2. Запирающие фильтры
- •3.4.3. Цветные светоделительные зеркала
- •3.5. Объективы и окуляры
- •4. Применение флуоресцентных красителей
- •4.1. Нуклеиновые кислоты
- •4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами
- •4.2. Иммунофлуоресценция
- •4.3. Флуоресценция нейромедиаторов
- •4.4. Двойное окрашивание
- •5. Микрофлуориметрия
- •5.1. Введение
- •5.2. Стандарты флуоресценции
- •5.3. Оборудование
- •5.3.1. Инвертированные микрофлуориметры
- •5.3.2. Сканирующие микрофлуориметры
- •5.4. Измерения содержания ДНК
- •5.4.1. Оборудование
- •5.4.2. Подготовка материала
- •5.4.3. Процедура окрашивания
- •5.4.4. Проведение измерений
- •6. Анализ изображения при флуоресценции
- •7. Сканирующая лазерная микроскопия
- •8. Литература
- •МИКРОМЕТРИЯ И АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Простая микрометрия
- •2.1. Измерения длины
- •2.1.3. Окуляр-микрометр сдвига
- •2.1.4. Другие методы измерения длины
- •2.2 Измерения углов
- •2.3. Измерение толщины
- •2.4. Счетные камеры
- •2.4.2. Техника работы с гемоцитометром
- •3.1.1. Определение АA в двухфазном препарате
- •3.2. Принципы измерения площади поверхности
- •4. Измерения с использованием дигитайзера
- •5.2. Измерения с помощью компьютера
- •6. Приборы и математическое обеспечение работ
- •7. Литература
- •ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ
- •1. Видеомикроскопия и оборудование для нее
- •1.1. Введение
- •1.1.1. Видеоусиление
- •1.1.2. Видеоинтенсификация
- •1.1.3. Цифровая обработка изображения
- •1.2.1. Условия ограниченного числа фотонов
- •1.3. Различные методы видеомикроскопии
- •1.3.1. Видеомикроскопия с усилением
- •1.3.2. Аналоговое усиление контраста
- •1.3.3. Цифровая обработка изображения
- •1.4.1. Камеры и контроллеры камер
- •1.4.5. Видеопроцессорные платы
- •1.4.6. Монофункциональные процессоры
- •1.4.7. Взгляд в будущее
- •1.5. Условия, налагаемые на микроскоп
- •1.6. Как соединить телекамеру с микроскопом
- •2.1. Различные виды VEC-микроскопии
- •2.2. Приготовление препаратов
- •2.3. Получение изображения
- •2.4. Интерпретация изображений
- •2.5. Типичные применения и ограничения метода
- •2.5.1. Светлопольная микроскопия
- •2.5.2. Темнопольная микроскопия
- •2.5.4. Фазовый контраст
- •2.5.5. Поляризационная микроскопия
- •2.5.7. Отражательная контрастная микроскопия
- •2.5.8. Флуоресцентная микроскопия
- •2.5.9. Примеры применения в биологии и биохимии
- •3.1. Введение
- •3.2. Процесс формирования изображения
- •3.2.1. Условия, касающиеся микроскопа
- •3.2.2. Получение статических изображений
- •3.2.3. Получение изображений подвижных объектов
- •3.3. Типичные приложения
- •3.3.2. Картирование отношений
- •3.3.4. Визуализация молекул
- •3.3.6. Люминесценция
- •3.3.7. Нейробиология
- •4.1. Пространственные измерения
- •4.2. Измерения по интенсивности
- •5.1. Видеозапись и редактирование
- •5.1.1. Стандарты видеотехники
- •5.1.2. Форматы видеопленок
- •5.1.3. Качество видеопленок
- •5.1.4. Видеомагнитофоны
- •5.1.5. Видеомагнитофоны с цейтраферной записью
- •5.1.6. Запись при видеомикроскопии
- •5.1.8. Копирование и редактирование видеозаписей
- •5.2.1. Оборудование
- •5.3. Перенос видеозаписей в видеофильм
- •5.4. Рисование с монитора
- •6. Благодарности
- •7. Литература
- •1. Введение
- •2. Классификация сегментов хромосом
- •2.1. Гетерохроматиновые сегменты
- •2.2. Эухроматиновые сегменты
- •2.3. Ядрышковые организаторы
- •2.4. Кинетохоры
- •4.2. G-окрашивание
- •4.2.1. ASG-метод
- •4.2.3. Метод Галлимора и Ричардсона
- •4.3. R-окрашивание
- •4.4. Q-окрашивание
- •4.4.1. Q-окрашивание с помощью акрихина
- •4.5.2. Процедура окраски
- •5.1. Окрашивание ДАФИ/дистамицином
- •5.2.1. Метод культивирования клеток
- •5.2.2. Методика окраски
- •5.3.2. Синхронизация с помощью БУДР [39]
- •5.3.3. Синхронизация с помощью ФУДР [13, 40]
- •6. Наблюдение и регистрация сегментов хромосом
- •6.3. Фотографирование сегментированных хромосом
- •6.4.1. Получение профилей сегментов
- •6.4.2. Отражательная микроскопия
- •6.4.3. Измерение полиморфизма хромосом
- •7. Благодарности
- •8. Литература
- •9. Литература для дальнейшего чтения
5.4. Рисование с монитора
Иногда на хороших рисунках деталей больше, чем на плохой фотографии. Для получения рисунков с экрана монитора можно воспользоваться прозрачной пленкой, накладываемой на телеэкран. Однако из-за толщины стекла в телевизионной трубке этот способ может вызвать определенные геометрические искажения. Лучше использовать следующий метод.
Тонкую (1—2 мм) стеклянную пластинку (такую, как для тонкослойной хроматографии) укрепляют с помощью струбцины под углом 45° перед центром вертикально расположенного экрана. Нижняя часть пластины касается монитора. Середина пластины должна находиться на равных расстояниях от экрана и от листа бумаги, который помещается под пластиной на столе. Если смотреть на пластину сверху, то будут одновременно видны оба изображения (листа бумаги и экрана). Можно также смотреть по горизонтали сквозь пластину на экран. Важно точно установить стеклянную пластину, особенно в тех случаях, когда телевизионный экран расположен не вертикально. Это можно сделать следующим образом.
1.Изменяйте высоту и угол наклона пластины до тех пор, пока экран не будет точно проецироваться на плоскость бумаги. Если экран искривлен, то углы будут проецироваться несколько ниже, а центр несколько выше бумаги.
2.Только после такой установки пластины можно сдвигать голову, не вызывая при этом смещения изображений и на бумаге. Бумагу для рисования лучше зафиксировать с помощью клейкой ленты.
3.Для удобства работы приглушите верхнее освещение и/или осветите бумагу лампой с регулируемой яркостью. В результате вы получите внизу изображение экрана в масштабе 1:1.
Такая же система может быть использована, если заменить бумагу планшетом дигитайзера, чтобы при отсутствии удобного оборудования переносить информацию с телевизионного экрана в компьютер.
6. Благодарности
Эта глава могла быть написана только благодаря Роберту Д. Ал лену (1927—1986), который щедро делился своим огромным опытом и знаниями в данной области во время совместной работы с одним из авторов (Вейссом) в летние сезоны 1984 и 1985 гг. Часть данной главы создана в значительной степени на основании записей многочисленных лекций, которые Боб читал на эту тему. Вейсс глубоко признателен также Шиниа Иноэ и коллегам по видеомикроскопической работе из Вудс-Хола за многочисленные дискуссии и советы.
7. Литература
1.Inoue, S. (1981) J. Cell Biol., 89, 346.
2.Inoue, S. (1986) Video Microscopy. Plenum Press, New York.
3.Allen, R. D., Travis, J. L, Allen, N. S. and Yilmaz, H. (1981) Cell Moti].. 1, 275.
4.Allen, R. D., Allen, N. S. and Travis, J. L. (1981) Cell Motil., 1, 291,
5.Allen, R. D., Allen, N. S. (1983) J. Microsc., 129, 3.
6.Willingham, M. C. and Pastan, I. (1978) Cell, 13, 501.
7.Reynolds, G, T. and Taylor, D. L. (1980) BioScinece, 30, 586.
8.Allen, R. D., Weiss, D. G., Hayden, J. H., Brown, D. Т., Fujiwake, H. and Simpson, M. (1985) J. Cell Biol., 100,
1736.
9.Weiss, D. G. (1986) J. Cell Sci. Suppl., 5, 1.
10.Arndt-Jovin, D. J., Robert-Nicoud, M., Kaufman, S. J. and Jovin, Т. М. (1985) Science, 230, 247.
11.DiGuiseppi, J., Inman, R., Ishihara, A., Jacobson, K. and Herman, B. (1985) BioTechniques, 3, 394.
12.Hecht, E. and Zajac, A. (1974) Optics. Addison-Wesley Publishing Co., Reading, MA.
13.Walter, R. J. and Berns, M. W. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6927.
14.Wick, R. A. (1987) Applied Optics, 26, 3210.
15.Bennett, H. S. (1950) In Handbook of Microscopical Techniques. McCIung, G. L. (ed.), Harper & Row (Hoeber), New York, p. 591.
16.Inoue, S. (1961) In The Encyclopedia of Microscopy. Clark, G. L. (ed.)3 Reinhold, New York, p. 480.
17.Conchello, J. A., Hansen, E. W. and Allen, R. D. (1987) Proc. 13th Northeast Bioeng. Conf. Philadelphia, p. 4.
18.Schnapp, B. J. (1986) Methods Enzymol., 134, 561.
19.Kachar, B. (1985) Science, 227, 766.
20.Ellis, G. W. (1985) J. Cell Biol., 101, 83a.
21.Lichtscheidl, I. and Url, G. W. (1987) Eur. J. Cell Biol., 43, 93.
22.De May, J. (1983) In Immunocytochemistry. Polak, J. and Van Noorden, S. (eds), Wright-PGS, London, p. 92.
23.Hoffman, R. (1977) J. Microsc., 110, 205.
24.Ellis, G. W. (1978) In Cell Reproduction. In Honor of Daniel Mazia. Dirk-sen, E., Prescott, D. and Fox, C. F. (eds), Academic Press, New York, p. 465.
25Allen, R. D. (1985) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 14, 265.
26Allen, R. D,, David, G. B. and Nomarski, G. (1969) Z. Wiss. Mikr. Mikro-tech., 69, 193.
189
27.Izzard, C. S. and Lochner, L. R. (1976) J. Cell Sci., 21, 129.
28.Beck, K. and Bereiter-Hahn, J. (1981) Microsc. Act., 84, 153.
29 De Brabander, M., Nuydens, R., Geuens, G., Moeremans, M. and De Mey, J. (1986) Cell Motil. Cytoskel., 6, 105.
30 Geerts, H., De Brabander, M., Nuydens, R., Geuens, G., Moeremans, M., De Mey, J. and Hollenbeck, P. (1987) Biophys. J., 52, 775.
31. Mathog, D., Hochstrasser, M. and Sedat, J. W. (1985) J. Microsc., 137, 241 and 253. 32 White, J. G., Amos, W. B. and Fordham, M. (1987) J. Cell Biol., 105, 41.
33 Kachar, В., Evans, D. F. and Ninham, B. W. (1984) J. Coll. Interface Sci., 100, 287.
34.Trendelenburg, M., Allen, R. D., Gundlach, H., Meissner, В., Troster, H. and Spring, H. (1986) In Nucleocytoplasmic Transport. Peters, R. and Trendelenburg, M. (eds), Springer-Verlag, Berlin, p. 96.
35.Allen, R. D. and Allen, N. S. (1981) Protoplasma, 109, 209.
36.Kachar, B. (1985) Science, 227, 1355.
37.Cohn, S. A., Ingold, A. L. and Scholey, J. M. (1987) Nature, 328, 160.
38.Weiss, D. G., Langford, G. M., Seitz-Tutter, D. and Keller, F. (1988) Celt Motil. Cytoskel., 10, 285.
39.Weiss, D. G., Keller, F., Gulden, J. and Maite, W. (1986) Cell Motil. Cytoskel., 6, 128.
40.Taylor, D. L., Amato, P. A., Luby-Phelps, K. and McNeil, P. (1984) Trends Biochem. Sci., 9, 88.
41.Tsien, L. Y. and Poenie, M. (1986) Trends Biochem. Sci., 11, 450.
42.Bright, G. R., Rogows-ka, J., Fisher, G. W. and Taylor, D. L. (1987) BioTechniques, 5, 556.
43.Bright, G. R., Fisher, G. W., Rogowska, J. and Taylor, D. L. (1988) Methods Cell Biol., 30, in press.
44.Peters, R. (1985) Trends Biochem. Sci., 10, 223.
45.Kapitza, H. and Jacobson, K. (1986) In Lateral Motion of Membrane Proteins. Techniques for the Analysis of Membrane Proteins. Ragon and1 Cherry (eds), Chapman and Hall, London, p. 345.
46.Yanagida, M., Morikawa, K., Hiraoka, Y., Matsumoto, S., Uemura, T. and Okada, S. (1986) In Application of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Taylor et al. (eds). Alan R. Liss, New York, p. 321.
47.Kron, S. J. and Spudich, J. A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 6272.
48.Wampler, J. E. (1986) In Application of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Taylor et al. (eds), Alan R. Liss, New York, p. 301.
49.Yoshimoto, Y., Iwamatsu, Т., Hirano, K., Hiramoto, Y. (1986) Dev. Growth Differ., 28, 583.
50.Schauer, A., Ranes, M., Santamaria, R., Guijarro, J., Lawlor, E., Mendez C., Chater, K. and Losick, R. (1988) Science, 240, 768.
51.O'Kane, D. J., Lingle, W. L., Wampler, J. E., Legocki, M., Legocki, R. Я. and Szalay, A, A. (1988) Plant Mol. Biol., 10, 387.
52.Purves, D. and Voyvodic, T. (1987) Trends Neurosci., 10, 398.
53.Blasdel, G. G. and Salama, G. (1986) Nature, 321, 579.
54.DeBiasio, R., Bright, G. R., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. and Taylor, D. L* (1987) J. Cell Biol., 105, 1613.
55.Haugland, R. P. (1988) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 2nd edn.
56.Allen, T. D. (1987) J. Microsc., 147, 129.
57.Wolf, R. and Fuldner, D. (1986) Mikrokosmos, 75, 375.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ХРОМОСОМ
А. Т. Самнер
1. Введение
Дифференциальное окрашивание (сегментирование) хромосом можно определить как применение специальных способов окрашивания, позволяющих получить различия в окраске по длине хромосом. В соответствии с этим строгим определением к сегментам хромосом не относится видимая структурная неоднородность хромосом, например диски политенных хромосом и хромомеры пахитенных хромосом, хотя в последнем случае есть достоверные данные о сходстве в распределении хромомеров и некоторых сегментов митотических хромосом [1]. Как бы то ни было, сущность метода сегментирования состоит в выявлении рисунка на хромосомах, в которых лет каких-либо очевидных структурных различий. Дифференциальное окрашивание хромосом — это, разумеется, только один из подходов к исследованию их организации, но достоинство данного метода состоит в том, что он позволяет получать различные типы сегментации, а это имеет большое значение, особенно в клинической цитогенетике и в эволюционных исследованиях.
В литературе описано большое число методов сегментирования хромосом и до сих пор изобретаются новые. На практике, однако, все эти методы можно разделить на несколько типов, классификация которых дана в разд. 2. В настоящей главе подробно рассматриваются несколько методов дифференциального окрашивания
190