оптических путей через фон и через структуру. Для каждой длины волны необходима отдельная калибровка гониометра.

3.Уравнение (2) представляет зависимость разности длин оптических путей от толщины препарата по оси z и разности показателей преломления препарата и среды, в которую он заключен. Таким образом, если измерены разность длин оптических путей и толщина, то необходимо измерить один из показателей преломления, а затем вычислить второй. В отношении ядра вы можете сделать это следующим образом: измерьте его размеры по осям х и у и примите, что его размер (t) по оси z такой же, как один из измеренных. Показатель преломления среды измерьте на рефрактометре, как указывалось выше.

4.Второй шаг можно повторить, используя другую длину волны, например красного света. Сопоставляя величины р. о. п. для красного и зеленого света, можно получить пару квадратных уравнений, из которых можно рассчитать два неизвестных, проведя повторное измерение, например коэффициента преломления раствора.

Сдвиг полос, изменение интенсивности либо окраски могут быть соотнесены с разностью длин оптических путей (сдвиг = толщина Х относительный коэффициент преломления) и использованы для вычисления таких параметров, как толщина пленки или масса ядра, непосредственно в живой клетке. Данный метод имеет определенные преимущества перед фазовым контрастом в иммерсионной рефрактометрии (табл. 2.4), так как при использовании его вокруг деталей изображения не возникает гало и градиенты изменений длин оптического пути хорошо видны. Прибор, однако, стоит несколько дороже, чем фазовая или DIC-система.

Втабл. 2.14 дается описание метода Жамина — Лебедева. Оно может быть полезным, поскольку во многих лабораториях соответствующее оборудование имеется и простаивает. Приборы такого рода подробно описаны Россом [2]. Их возможности могут быть продемонстрированы на примере клеток буккального эпителия, упоминавшихся выше. Микроскопы могут различаться по способу разделения лучей в них. Некоторые из них отводят луч вбок (рис. 2.4,5). Тогда лимитирующим фактором для микроскопии является размер отдельного объекта, который не должен превосходить расстояния между лучами. Другие микроскопы имеют систему с двумя фокусными расстояниями и поэтому не имеют указанного выше ограничения. Как показано на рис. 2.4, в этих микроскопах используется поляризованный свет, причем поляризаторы служат для расщепления луча и последующего совмещения двух лучей.

Втабл. 2.14 содержится описание метода, пригодного для наблюдения клеток буккального эпителия или других препаратов с дискретным содержимым при помощи системы с отведенным вбок лучом. В первой части таблицы (А) описано использование микроскопа для получения контраста, а вторая часть иллюстрирует его возможности для количественных измерений. Разумеется, каждая фирма-изготовитель снабжает свой микроскоп собственными инструкциями, однако принципы его настройки будут такими же, как описано здесь.

Интерферометрические микроскопы были с успехом применены, например, для определения коэффициентов преломления ядер или головок спермиев. Если известна зависимость коэффициента преломления от концентрации, то можно вычислить концентрации и даже массы для столь малых объектов. Интерференционный микроскоп может, разумеется, быть использован, так же, как и фазово-контрастный микроскоп, для рефрактометрии. На самом деле, по упоминавшимся выше причинам, он даже больше подходит для этих целей. С помощью интерференционной микроскопии были сделаны значительные работы, например исследования мышц, выполненные Хаксли и Нидергерке (Huxley, Niedergerke), и исследования нуклеиновых кислот в ядре, выполненные Ш. Г. Дэвисом (Н. G. Davies) в 1950-е годы. Более подробно об этом см. работу Росса [2].

Возможности применения интерференционной техники для количественной цитохимии в настоящее время перекрываются с возможностями другого метода — фотометрии флуоресценции меченых высокоспецифичных антител.

По крайней мере два интерференционных микроскопа — Interphaco С. Zeiss и Pluta (P. Z. О., Польша) пока поступают в продажу.

6.3. Интерференционная отражательная микроскопия

6.3.1. Введение

Интерференционная отражательная микроскопия (ИОМ) — это метод для исследования ширины промежутков между двумя оптически прозрачными структурами. Если предположить, что одна из поверхностей плоская, то можно исследовать и даже измерить топографию второй. При использовании для количественных измерений данный метод позволяет определить промежутки равной ширины. На самом деле, по причинам, которые будут обсуждаться ниже, этим методом можно исследовать только промежутки между клетками и субстратом в диапазоне 10—30 нм. При умелом использовании метод позволяет определить степень приближенности клетки к субстрату, на котором они растут, если расстояние не превышает 30 нм. Данный метод был введен в биологию в 1964 году [11].

34

Рис. 2.5. Интерференционная отражательная микроскопия. А. Диаграмма хода лучей. Штриховая линия обозначает падающий свет; пунктирная линия — отраженный пучок света. Падающий и отраженный пучки света не вполне идентичны, но разница между ними слишком мала, чтобы отразить ее на рисунке. Б. Детали препарата: I — падающий свет; R1 и R2— свет, отраженный от границ раздела покровное стекло—среда и препарат—среда соответственно; d — расстояние между поверхностью клетки и покровным стеклом; n — показатель преломления стекла, заливочной среды, препарата и т. д. Обратите внимание, что фазовая разность (∆) между R1 и R2 пропорциональна расстоянию d. Волна R1 сдвинута на λ/2 из-за отражения на границе, и, таким образом, происходит частичное нарушение интерференции между R1 и R2, полная разность фаз между которыми составляет ∆+ λ /2.

6.3.2. Физические основы метода

Физические основы метода понятны из рис. 2.5. Свет отражается от каждой границы, где происходит изменение коэффициента преломления, например, от границы между стеклом чашки и налитым в него раствором, а также от границы между клеткой и культуральной средой. Таким образом, свет, падающий под прямым или близким к прямому углом на границу раздела фаз стекло — вода, а затем на границу раздела вода

— плазмалемма, дает две отраженные волны, различающиеся по фазе (кроме некоторых специальных случаев). Эти две отраженные волны, поскольку они имеют разные фазы, будут давать интерференционную картину. Оптические основы данного явления подробно описаны в статье [12].

Интенсивность результирующего отраженного света обусловлена коэффициентами преломления всех трех сред, а также величиной промежутка. Количественные соотношения для простой трехслойной системы или для тонкого слоя между двумя квази - бесконечными структурами определяются по уравнению:

где р есть интенсивность отраженного света, 0 — угол падения, d — толщина слоя, по — коэффициент преломления стекла, n — коэффициент преломления клеток, а п1 — коэффициент преломления в промежутке между клетками и стеклом. Данное уравнение справедливо при условии, что свет падает отвесно. На практике, разумеется, объектив микроскопа освещает препарат конусом света, угол которого определяется числовой апертурой (NA) объектива, за исключением тех случаев, когда имеется и используется апертурная диафрагма. Следует отметить, что на самом деле лишь очень немногие объективы имеют ту NA, которая указана на них. Вопрос об эффекте косо падающего света тщательно изучался Гингеллом и Тоддом [12, 13]. Они показали, что для заметной интерференции, которая является результатом взаимодействия лучей за пределами нулевого порядка, влияние большой NA будет сказываться в том случае, если она внесет существенные изменения по

сравнению с отвесно падающим светом. Однако нулевой порядок интерференции от поверхности клетки возникает при расстояниях, меньших чем 30—40 нм. На таких расстояниях, как показали Гингелл и Тодд [12], ожидаемая интерференция будет очень близка к той, которая возникает при освещении конусом света. А поскольку известно, что наибольший интерес представляют расстояния 0—30 нм, то ясно, что использование обычного эпиосвещения вполне допустимо.

В свое время была дискуссия о том, какое именно соотношение интенсивностей света можно различить в

35

микроскоп [12—15]. Отчасти она обусловлена тем, что неизвестны точные значения показателей преломления различных слоев, но если принять обычные для биологических исследований показатели преломления (стекло—1,52; среда—1,34; плазматическая мембрана клетки — около 1,45), то максимальная интерференция будет наблюдаться при минимальной толщине щели, а первый пик — при толщине около 50 нм. Однако если клетки тонкие, то интерферировать может и свет, отраженный от противоположной стороны клетки [14]. Поскольку ожидаемая интенсивность света при интерференции от щели нулевой толщины очень мало отличается от интенсивности при интерференции от щели в 10 нм, то с помощью ИОМ в действительности невозможно отличить молекулярный контакт плазмалеммы с субстратом от адгезии, при которой есть определенный промежуток между клеткой и субстратом.

Следует также учитывать интерференционные эффекты, возникающие в более сложных системах, напоминающих в большей или меньшей степени реальные биологические структуры [12 и 13].

Некоторые основные инструкции для изучения тест-объекта (слюды) и таких препаратов, как, например, живые куриные фибробласты, растущие на покровном стекле, приведены в табл. 2.15.

6.3.3. Интерпретация результатов

1. Качественная интерпретация результатов. В тех биологических препаратах, где в качестве субстрата для клеток используются покровные стекла, сочетание показателей преломления обычно таково, что области наиболее тесных контактов плазмалеммы со стеклом выглядят черными или темно-серыми. Если стекло заменить на полистиреновую подложку, то изображение будет практически лишено контраста. Прикрепление фибробластов и клеток других типов к подложке сопровождается образованием фокальных контактов, которые представляют собой маленькие участки относительно тесного, возможно, очень плотного контакта клетки с субстратом. Эти контакты видны как отдельные темные пятнышки [16], отличающиеся от участков серого цвета, находящихся более далеко от субстрата и получивших название близких контактов [17]. Были сделаны интересные наблюдения, связанные с влиянием различных типов белкового покрытия субстрата на образование контактов. Однако при интерпретации таких изображений следует иметь в виду, что в их возникновении могли принимать участие: 1) наложение друг на друга в исследуемом препарате слоев с различными показателями преломления, например слоев адсорбированных белков, а также 2) отражения от другой стороны клетки, если она лежит близко к подстилающей поверхности.

Большие возможности для определения этих эффектов могли бы открыться при использовании покровных стекол из сапфира, которые, обладая гораздо большим показателем преломления, чем стекло, могли бы дать изображения совершенно другого сорта. Интересно отметить, что для трех-четырехкомпонентной системы и для обычно ожидаемых показателей преломления существует ограниченный диапазон возможных интерференционных картин.

Таблица 2.15. Основные инструкции по отражательной интерференционной микроскопии (ОИМ)

1.Используйте микроскоп с осветителем падающего света (такое освещение часто называют освещением по Плоэму), снабженным ртутной лампой (мощностью не менее 100 Вт) или ксеноновой дуговой лампой в качестве источника света. Светоделительная пластинка не должна быть избирательной по отношению к длине волны, поэтому любое дихроичное зеркало следует заменить нейтральной пленкой, покровным стеклом с напылением серебра и отражением 50% или подходящим зеркалом. Использование светоделительных систем на основе призм может привести к некоторому смещению изображений. Полевая диафрагма должна быть вставлена в ход лучей. Желательно, чтобы были гнезда для фильтров, чтобы устанавливать монохроматическое освещение и/или снижать общую интенсивность света. При использовании ртутной лампы помните, что она дает очень мало красного света, так что любая интерференция, дающая красный свет или требующая его, будет сравнительно слабой.

2.а) Используя падающий свет, исследуйте кусочек красной мусковитной слюды с применением объектива Х10 б) Сфокусируйте микроскоп на поверхность слюды. Убедитесь, что поверхность слюды около скола

слегка расщеплена, так что между некоторыми пластинками есть воздух. Они будут служить источниками интерференции. Слюду следует рассматривать на воздухе. Она является очень контрастным образцом.

в) Проверьте центровку света и убедитесь, что в изображении практически нет вуали. Если вуаль присутствует, то закройте полевую диафрагму и, если необходимо, покройте внутренние поверхности тубусов микроскопа черной матировкой для оптики, чтобы понизить отражение от внутренних металлических поверхностей и т. д.

3.Определите кольца нулевого и более высоких порядков по их окраске в белом свете. Затем посмотрите их при монохроматическом освещении. Изображение надо интерпретировать с точки зрения расстояний между расщепленными слоями, которые обнаруживаются в изображении.

4.Повторите этапы 2 и 3 с использованием объективов Х40 и Х50.

5.Биологические приложения.

36

а) Возьмите клетки, выращенные на стекле или прикрепленные к покровному стеклу с высоким показателем преломления. Не используйте полистиреновые покровные стекла.

б) Убедитесь, что покровное стекло достаточно тонкое для того, чтобы использовать его с объективом Х50 или X100.

в) Положите покровное стекло клетками вниз на предметное так, чтобы клетки не высохли во время наблюдения.

6.Используя фазовый контраст в проходящем свете, найдите те участки в культуре, которые вы хотите рассматривать с помощью ОИМ. Тщательно удалив следы влаги с верхней стороны покровного стекла, рассмотрите препарат, используя объективы Х50 или Х100 с NA не менее 0,8 и иммерсией, если это соответствует их конструкции.

7.Замените проходящий свет на падающий. Очень осторожно наведите фокус на препарат. Он будет в фокусе при очень небольшом сдвиге по сравнению с фазовым контрастом. Фокус препарата располагается вблизи фокуса полевой диафрагмы (если она закрыта достаточно, чтобы быть видимой в поле зрения), так что начинайте работать со слегка закрытой диафрагмой. Наведите фокус на поверхность клетки таким образом, чтобы контрастируемый объект оказался видимым.

8.Установите полевую диафрагму, набор фильтров и дополнительные линзы для получения оптимального контраста.

.9. Обратите внимание, что числовой апертуры объективов X10, X20 и большинства объективов Х40 недостаточно, чтобы получить адекватное изображение в биологических системах.

10.Для определения того, к какому порядку принадлежат кольца, используйте белый свет. Будьте внимательны в отношении красных колец, которые упомянуты выше в первом пункте. Изображение следует истолковывать с точки зрения расстояния между клетками и покровным стеклом.

Наблюдаемые степени запаздывания фазы указывают на наличие коэффициента преломления, в просвете близкого к 1,34, а в плазмалемме — к 1,41. Все время следует помнить, что боковое разрешение ИОМ сравнительно, мало.

2. Количественная интерпретация результатов. Для количественной интерпретации получаемых с помощью ИОМ картин необходимо провести оптическое моделирование системы и подобрать наиболее подходящую к результатам модель. Это основная причина того, что лишь немногие количественные исследования были выполнены данным методом. Трудно также исключить ошибки, возникающие из-за рассеянного света. К счастью, прибор осуществляет внутреннюю калибровку практически в каждом изображении. В качестве опорного изображения служит отражение от одной поверхности раздела стекло— раствор. Первые простые вычисления были проведены Кертисом [11] с помощью уравнения, приведенного выше. Сравнительно недавно Бэйли и Гингелл [18] исследовали изображения, получаемые от близких и фокальных контактов, используя математический аппарат для моделирования объекта, содержащего до пяти тонких слоев, которыми являются: просвет, адсорбированный белок, плазмалемма, кортикальная цитоплазма и эндоплазма, и сравнивая расчетные величины с реально измеренными. Как ни странно, но до сих пор никто не пытался для проверки корректности создаваемых моделей воспользоваться субстратами с различными показателями преломления.

7. Красители, фильтры, изготовление срезов и препаратов

В ряде глав настоящей книги подробно рассматриваются современные методы контрастирования с помощью различных красителей, в том числе связанных с антителами, хотя в ее задачи и не входит перечисление всех красителей и методов их применения. Использование для получения контраста красителей с поглощающими хромофорами основано на том, что красители поглощаются теми или иными структурами препарата, различающимися по своим физико-химическим свойствам. На свойства данных структур может сильно влиять их окружение.

7.1. Красители

Методы изучения живого материала, основанные на использовании красителей, были вытеснены оптическими методами, такими как фазовый контраст и DIC-метод, однако есть случаи, когда физикохимические свойства препарата могут быть изучены с помощью флуоресцирующих красителей. Эти красители используются в достаточно низкой концентрации, в которой они не токсичны для клеток и в то же время дают достаточно яркое изображение на черном фоне. Применявшиеся в прошлом нефлуоресцирующие красители давали цветное окрашивание за счет поглощения света, поэтому, чтобы получилось видимое для глаза поглощение, они должны были применяться в значительной концентрации. В таких количествах красители обычно токсичны.

Флуоресцентные красители нужны в очень малых количествах, и нет надобности применять токсические концентрации. Плоэм [19] пишет о возможности использования акридинового оранжевого в разведении 1:100000 на фосфатно-солевом буфере для окрашивания макрофагов и фибробластов.

Раньше, когда еще не были введены современные правила работы с экспериментальными животными, можно было взять каплю крови из хвоста живой мыши, зараженной трипаносомами, и смешать ее с каплей

37