покровного стекла и на несколько десятков микрон ниже (используя обычный, не инвертированный микроскоп), так как объективы большого увеличения рассчитаны на получение наилучшего изображения на расстоянии около 170 мкм от своей передней поверхности. За исключением тех случаев, когда используются сухие объективы (более предпочтительны масляно-иммерсионные), рекомендуется применять покровные стекла № 0 (толщиной 80—120 мкм) вместо стандартных (толщиной примерно 170 мкм) (например, марки Gold Seal фирмы Clay Adams Co., или О. Kindler GmbH). Соответственно целесообразно применять и более тонкие предметные стекла (0,8—0,9 вместо 1 мм).
Водные препараты следует предохранять от высыхания, полностью замазывая покровное стекло по периметру лаком для ногтей или, если исследуются «живые» препараты, например микротрубочки, выдавленная цитоплазма или культивируемые клетки, используя для герметизации смесь VALAP. Последняя состоит из равных весовых частей вазелина, ланолинового масла и парафина (температура плавления 51—53 °С) и плавится при температуре около 65 °С. Смесь наносится по периметру покровного стекла специальной кисточкой с кончиком из хлопка. Если образец представляет собой суспензию, то при использовании стандартного покровного стекла следует брать аликвоты не более, чем по 5—10 мкл, чтобы препарат был очень тонким (около 10 мкм), что позволит получить наилучшее качество изображения.
Работая с инвертированным микроскопом, препарат необходимо класть покровным стеклом вниз. На большинстве столиков микроскопов такой препарат будет соприкасаться замазкой со столиком и его не удастся расположить плоско. Поэтому вместо обычного предметного столика лучше использовать металлические рамки размером под стандартное предметное стекло толщиной 0,8—1 мм. Средняя часть рамки вырезается, так что получается U-образный держатель. К верхней поверхности рамки с помощью липкой ленты прикрепляется покровное стекло большого размера так, чтобы оно перекрывало отверстие. Если это необходимо, можно использовать покровное стекло № 0, поскольку для наблюдений его верхняя поверхность подходит лучше всего. После того как препарат был использован, сверху накладывается покровное стекло стандартных размеров и толщины, затем препарат запечатывается.
В тех случаях, когда необходимо рассматривать более толстые препараты, такие как срезы ткани, срезы, полученные на вибратоме, или пучки нервов, рекомендуется использовать только технику дифференциального интерференционного контраста или косое освещение [19]. При этом хорошие изображения серийных оптических срезов можно получить только для слоя толщиной в 10—20 мкм, обращенного к фронтальной линзе объектива, а по мере углубления в ткань качество изображения будет быстро ухудшаться.
2.3. Получение изображения
Поскольку в методе VEC-микроскопии есть несколько этапов, отличающихся от таковых в обычной микроскопии, следует более подробно обсудить процесс формирования изображения. Если необходимо провести только аналоговое усиление, то изображение получается после этапов 1—5. Последующие шаги ведут к получению большего разрешения и визуализации субмикроскопических объектов. Выбранная для описания методика в основном соответствует AVEC-DIC-микроскопии, но если применения DIG не требуется, то этап 4 может быть опущен; если пользователь не хочет следовать прописи, приводимой Алленом (AVEC), для него могут оказаться полезными пояснения, приведенные в разд. 2.1.
1.Глядя в окуляры или на монитор (при уменьшенном увеличении) найдите препарат. Если весь препарат состоит из материала, размеры которого выходят за пределы разрешения (фракции из градиента плотности, суспензия микротрубочек, неокрашенные электронно-микроскопические срезы— рис. 8.2), то найти плоскость препарата будет трудно. Тогда уменьшите освещение с помощью диафрагмы конденсора и/или поляризаторов либо призм и поищите на препарате загрязняющие его крупные частицы. Если их нет, то сделайте отпечаток пальца на одном из углов покровного стекла со стороны препарата и воспользуйтесь им для фокусировки.
2.Установите освещение по Кёлеру (гл. 1). После грубой установки освещения следует точно выбрать нужную плоскость для препарата. Затем окончательно установите конденсор, но уже применительно к монитору (проверьте, достаточно ли снижена освещенность чтобы не повредить телекамеру). Полевую диафрагму нужно отцентрировать на мониторе и открыть так, чтобы она исчезла из поля зрения. Если полевая диафрагма открыта слишком сильно, то большинство адаптеров микроскоп—камера с проективами и окулярами большого увеличения будут давать мешающее яркое пятно в центре изображения (рис. 8.4). Если при правильной установке освещения пятно сохраняется, то закройте диафрагму проектива или установите самодельную диафрагму так, чтобы отсечь периферический свет на выходе микроскопа. Обратите внимание, что при используемых здесь больших апертурах и увеличениях, установка освещения по Кёлеру должна быть сделана заново, если вы передвинули фокус больше, чем на несколько микрон.
Поскольку дальше мы будем применять очень значительное усиление контраста, то следует как можно лучше установить освещение, в первую очередь точно отцентрировать лампу и установить коллекторную линзу. При больших увеличениях необходимо собрать как можно больше света. Некоторые исследователи используют для этой цели вместо установки света по Кёлеру так называемое «критическое» освещение, когда источник света фокусируется непосредственно на плоскость препарата [18]. Это противоречит обычной микроскопической практике, так как может привести к крайне неравномерному освещению вследствие того, что нить или дуга лампы будет накладываться на изображение препарата, и ее придется вычитать цифровым способом (вычитание фона). Критическое освещение может, однако, оказаться полезным в тех случаях, когда
166
свет делается исключительно гомогенным за счет рассеяния в световоде [2, 18, 20].
3.Чтобы использовать максимально возможную числовую апертуру для получения максимального разрешения, полностью откройте диафрагму конденсора и ирисовую диафрагму объектива (если она имеется). Предварительно примите меры по защите телекамеры на данном этапе от высокой интенсивности света. В результате открывания диафрагмы конденсора оптическое изображение ухудшается, поскольку оно становится слишком ярким и плоским для глаз. Такая установка света дает в результате очень маленькую глубину фокуса, особенно для дифференциального интерференционного контраста (оптический срез для объектива ХЮО составляет 0,3 мкм или даже меньше). Если требуется большая глубина фокуса (например, при просмотре разбавленной суспензии), то ее можно достичь, закрывая диафрагму конденсора, но желательно, чтобы ее отверстие перекрывало не менее 1/4 апертуры объектива.
4.(Только для поляризационной техники). Установите поляризатор (AVEC-POL) или основную призму компенсатора (AVEC-DIC) на смещение задержки на 1/9 А, (прежде чем устанавливать их, прочтите разд. 2.1. чтобы разобраться, действительно ли вам нужна такая установка). Оптическое изображение, видимое в окуляры, исчезнет из-за интенсивного светорассеяния. Уменьшите освещенность, чтобы защитить телекамеру (но диафрагму не закрывайте).
Если у вас имеются принадлежности для установки компенсатора Сенармона, рекомендуемой Алленом с соавт. [3, 4] (рис. 8.9, Б), то установите их под углом 20° к положению скрещивания. Начальная установка компенсатора Сенармона производится следующим образом.
а) Уберите из хода лучей обе призмы Волластона и четвертьволновую пластинку. б) Установите поляризатор и анализатор на наибольшее поглощение.
в) Введите четвертьволновую пластинку и установите ее на 0° (максимальное поглощение).
г) Введите призму Волластона и установите ее на наилучшее симметричное поглощение (если возможно, проверьте симметричность распределения интенсивности света с помощью фазового телескопа).
д) Возьмите вращающийся анализатор и, используя его в качестве компенсатора, установите, как считаете нужным (сдвиг на 1/9 длины волны соответствует повороту на 20°, сдвиг на 1/4 длины волны — повороту на
45°).
Если вы не имеете такой калиброванной системы, то во-первых, двигая юстируемую призму Волластона, определите расстояние между положениями поглощения (0°) и максимального пропускания (90°, или Я/2), затем оцените и выберите положение, соответствующее сдвигу на 1/9 волны или 20° (рис. 8.10). Многие микроскопы, снабженные DIC-системой для биологических исследований, не позволяют делать фазового сдвига на 90°, а некоторые даже и на 20°, так как для наблюдения глазами достаточно фазового сдвига на несколько градусов. Однако изготовители микроскопов выпускают подходящие детали в своих комплектах для микроскопии минералов.
На этом этапе вам надо удостовериться, что в телекамеру попадает достаточно света для того, чтобы она работала на уровне, близком к насыщению. Некоторые фирмы для этой цели ставят красные и зеленые встроенные светодиоды. При правильном уровне освещенности вы увидите на экране монитора слегка модулированное изображение, в то время как совершенно плоское изображение или его полное отсутствие свидетельствуют о недостатке света. В последнем случае, глядя на экран, вновь настройте освещение, если это возможно. Если необходимо, то уберите все рассеивающие элементы или возьмите лампу большей яркости. Открывание поляризаторов на угол, больший чем 20°, не улучшит качества изображения. Если имеется избыточный свет, то уменьшите освещенность (используя лампы с регулируемой яркостью) или (при работе с дуговыми лампами) установите нейтральные серые либо другие светофильтры, можно также повернуть поляризаторы на несколько градусов ближе к положению скрещивания.
При IVEC-микроскопии рассеянный свет недопустим, поэтому поляризаторы устанавливаются вблизи положения скрещивания, и используется специально просветленная оптика, за счет которой еще больше уменьшается количество рассеянного света. Для снижения яркости вам не потребуются светофильтры, а вот намного более яркая лампа для насыщения телекамеры будет, вероятно, нужна. Аналоговое усиление. Для получения хорошего контраста увеличьте усиление камеры. Затем подайте на мишень камеры напряжение смещения. Подавая напряжение, всегда останавливайтесь до того, как части изображения начнут пропадать, становясь слишком черными или слишком белыми. Повторите процедуру несколько раз, если это необходимо. Убедитесь в том, что монитор, на котором будут наблюдать за изменениями, не настроен на максимальный контраст или яркость и правильно установлен (разд. 5.1). Аналоговое усиление увеличивает контраст препарата, но, к сожалению, подчеркивает одновременно наличие частиц пыли, неравномерность освещения и несовершенства оптики. Эти артефакты, называемые «крапом», накладываются на изображение образца и в некоторых случаях полностью маскируют его (рис. 8.2 и 8.4). Дефекты изображения, вносимые фиксированным распределением пятен (крапом) или значительной неравномерностью освещения, можно удалить с помощью цифрового усиления (рис. 8.2).
Если нет возможности произвести цифровое усиление, то при проведении аналогового усиления надо остановиться на той стадии, когда появляющийся крап или неравномерное освещение начинают ухудшать изображение. Если ваш блок управления телекамерой позволяет это сделать, то введите аналоговую корректировку тени и воспользуйтесь другими способами аналогового улучшения изображения (разд. 1.4.1 и рис. 8.6). Тщательная очистка внутренних оптических поверхностей микроскопа, в особенности поверхностей в проекционных системах, обращенных к телекамере (окуляр, объектив камеры), обычно позволяют получить
167
такие изображения, к которым может быть применено значительно большее аналоговое усиление контраста. Обнаружение пыли. Если изображение частиц или крапа вращается при вращении трубки телекамеры, то это означает, что частицы располагаются в оптическом пути перед камерой. Неподвижная пыль располагается
на поверхности трубки телекамеры. Поверните окуляр или объектив камеры для того, чтобы обнаружить наличие на них пыли. Пыль следует удалить с помощью воздушного пистолета низкого давления или кисточки для протирки оптики. Если это не помогает, то воспользуйтесь бумагой для протирки линз или обезжиренной кисточкой с хлопковым кончиком (с деревянной, но не пластиковой палочкой), смоченной этанолом или эфиром. Обрабатывать поверхность надо от центра к периферии круговыми движениями, тщательно избегая надавливания. Пыль или крап, которые расфокусируются при расфокусировке препарата, относятся к последнему.
6. Постарайтесь удалить препарат из поля зрения, переместив столик, или (при использовании дифференциального интерференционного контраста) сделайте его невидимым, расфокусировав микроскоп (при этом желательно вращать микровинт так, чтобы фокус перемещался в сторону покровного стекла). В результате получится изображение, которое содержит только дефекты вашей микроскопической системы (крап) (рис. 8.2, В и 8.4, Л). Однако при использовании такого метода, как фазовый контраст, эта процедура не даст удовлетворительных результатов.
Рис. 8.10. Зависимость интенсивности (яркости изображения) и контраста (разд. 1.3.2) от запаздывания фазы при DIC-микроскопии фазовых объектов. Сдвиг фазы вносится и регулируется за счет бокового перемещения призмы Волластона или установки компенсатора Сенармона. За счет этого положительный или отрицательный градиент фазы на образцах превращается в контраст, создавая таким образом избыточное освещение (7Я) или тень (/ф) по сравнению с нейтральным серым фоном (7Т). Сдвиг фазы на дт/2 радиан соответствует Я,/4, то есть 1/4 длины волны. Можно показать, что теоретически наибольший контраст достигается при сдвиге, составляющем около л/2 (вертикальные стрелки). Из-за рассеянного света освещенность фона в изображении (/я) в данном положении сравнительно велика, и ее надо компенсировать напряжением смещения на трубке (воспроизводится по работе [4] с разрешения авторов).
7.Вычитание фона (крапа). Сохраните («заморозьте») изображение фона, желательно усредненное по нескольким кадрам, и вычитайте его из всех последующих видеокадров. Вы получите абсолютно ясное и чистое изображение, которое, однако, может иметь слабый контраст. Если оказались «пропущенными» области, которые должны быть серыми и плоскими, то это значит, что исходное изображение было слишком контрастным, из-за чего нельзя было правильно произвести вычитание фона. Уменьшите усиление камеры, отрегулируйте напряжение смещения и повторите процедуру (рис. 8.2, Г, Д и 8.4, Г).
8.Выполните процедуру цифрового усиления таким же образом, как указано на этапе 5. Это дает возможность выбирать между растягиванием выбранного диапазона уровней серого (установка «ширины») и сдвигом получаемого изображения вверх или вниз по шкале уровней серого (установка «уровня») до тех пор, пока не получится хороших результатов (рис. 8.2, Д). Если возможно, то выведите на экран монитора гистограмму уровней серого и выберите верхний и нижний пределы, которые будут соответствовать в изображении яркому белому и насыщенному черному цвету. Если изображение содержит шумы (точечные шумы), то надо перейти к следующему этапу (9).
9.Воспользуйтесь усредняющей функцией в последовательном (обратная фильтрация) или прыгающем
(усреднение от двух до четырех кадров) режиме. Это позволит наблюдать в препарате движение объектов, но очень быстрые движения и шум, возникающий из-за флуктуации в отдельных пикселах, будут усреднены и пропадут. Усреднение в течение более продолжительных промежутков времени отфильтрует все
168
нежелательные движения, например беспорядочное броуновское движение мелких частиц в суспензии. Таким образом, вы получите только изображение неподвижных частиц.
Нужно отметить, что не все видеопроцессоры способны одновременно выполнять операции вычитания фона и последовательного усреднения кадров. Если ситуация именно такова, то следует иметь в виду, что, как правило, усреднение больше дает для улучшения изображения при работе VIM-методом, тогда как вычитание фона предпочтительнее при VEC-микроскопии, хотя в каждом конкретном случае это надо проверять экспериментально. Другой способ обойти данное препятствие — это хранить изображения с вычтенным фоном или усредненные изображения (плюс «пустое» изображение, которое в дальнейшем используется в качестве фонового) на магнитной ленте или диске, и затем последовательно проигрывать и пропускать их через процессор для дальнейшей обработки.
10. Существует много способов пространственной фильтрации, которыми можно воспользоваться для снижения шума, контрастирования краев объекта или уменьшения теней. Они были описаны применительно к анализу одиночных изображений в гл. 7, но некоторые из видеопроцессоров позволяют проводить такую фильтрацию в реальном времени, давая возможность наблюдать процессы в живых объектах во время телевизионной съемки до записи изображения.
2.4. Интерпретация изображений
В отличие от электронно-микроскопических изображений, в которых действительно разрешаются субмикроскопические объекты (рис. 8.11, Л), размеры объектов, наблюдаемых с помощью AVEC-DIC- микроскопии, не обязательно отражают их реальную величину. Изображения объектов, размеры которых (100—250 нм) находятся за пределом разрешения, в зависимости от оптики и длины волны используемого света, растягиваются за счет дифракции до размера, соответствующего пределу разрешения светового микроскопа. В случае двулучепреломляющих объектов, располагающихся под углами, очень близкими к 45° или 135°, их видимая толщина может в некоторой степени зависеть от взаимной ориентации объектов (рис. 8.11, Б). Хотя по размеру изображения нельзя судить о том, относится оно к одному или к нескольким субмикроскопическим объектам, все же иногда это можно оценить, исходя из контраста изображения. Так, пара микротрубочек будет иметь ту же толщину, что и одиночная микротрубочка, но контраст изображения будет в два раза выше. Если большое число субмикроскопических объектов отделены друг от друга расстояниями менее 200 нм (например, пузырьки в синапсе), то они останутся невидимыми, но если расстояние между ними будет больше предела разрешения светового микроскопа, то их можно отчетливо различить. Помните также, что если применяется вычитание сфокусированного изображения или усреднение (рис. 8.5), то в обработанном изображении могут исчезнуть соответственно неподвижные или подвижные части препарата.
Рис. 8.11. Схема, иллюстрирующая возможности визуализации объектов при различных методах микроскопии. А. Просвечивающая электронная микроскопия: все мембранные и цитоскелетные элементы в цитоплазме могут быть разрешены и представлены в изображении с истинными размерами. Однако просвечивающую электронную микроскопию в большинстве случаев невозможно применить к живым или обводненным препаратам. Б. AVEC-DIC-микроскопия позволяет визуализировать объекты, размеры которых меньше, чем предел разрешения светового микроскопа, но больше 10—20 нм. Однако эти объекты будут видны не в реальном масштабе; из-за дифракции их размер увеличится до предела разрешения. В. Для изображения, получаемого при дифференциальной интерференционной микроскопии, характерна отброшенная в одну сторону тень. Наименьшие видимые объекты имеют кажущийся размер порядка теоретического предела разрешения. Вез — аксоплазматические или синаптические пузырьки диаметром около 60 нм; МТ — митохондрия; НФ — нейрофиламенты; прямая линия соответствует микротрубочке (25 нм в диаметре); наибольшая везикулярная органелла имеет диаметр около 250 нм (воспроизводится по работе [9] с разрешения авторов).
169