перекрывание, он, однако, мало приспособлен для количественного определения размеров, подсчета площадей и численностей, так что для этого приходится использовать специальные приборы. С восемнадцатого столетия в микроскопии применяется метод измерения длины с помощью простейших приспособлений, которые являются прообразами нынешних приборов. В девятнадцатом столетии, благодаря совершенствованию микроскопа точность этих основных методов измерений возросла, их стало возможно использовать при работе на пределе разрешающей способности и увеличений. Однако только в последние 30 лет благодаря развитию электроники и, совсем недавно микрокомпьютеров, техника измерений стала действительно точной. К тому же появилась возможность измерять не только линейные размеры, но и такие параметры объекта, как площадь, периметр, величина, оптическую плотность и многие другие. Полученные в результате таких измерений данные можно хранить, использовать для проведения статистического анализа с целью определения степени корреляции и доверительного уровня, что помогает обнаруживать неожиданные взаимосвязи между многочисленными переменными.

2. Простая микрометрия

Хотя в наши дни измерения часто проводятся на сложном электронном оборудовании, присоединенном к микроскопу, однако в обычной практике рядовые микроскописты будут, вероятно, использовать в основном простые методы. Следует помнить, однако, что эти простые методы имеют свои ограничения и пригодны лишь для определения длины, углов и численности объектов. С помощью стереологической техники можно с высокой точностью определить некоторые другие параметры, например площадь, плотность поверхности, парциальный объем, размеры зерен, геометрические параметры.

2.1. Измерения длины

Наиболее часто возникает необходимость узнать длину объекта или его диаметр, если объект имеет округлую форму. Любое измерение длины основано на сравнении объекта со шкалой. В обычной жизни, чтобы узнать длину объекта, вдоль него легко можно протянуть рулетку и прочесть ее показания. В микроскопе это сделать не так просто. Хотя в принципе можно изготовить предметные стекла с точными линейками, но на практике на такие стекла препараты не монтируют. Вместо этого микроскопист накладывает на изображение объекта изображение промежуточной шкалы с условными делениями, которая заменяет рулетку. После соответствующей калибровки с помощью мерной шкалы промежуточная шкала, представляющая собой помещенную в окуляр сетку, может быть использовала для измерений. Другие методы будут рассмотрены в разд. 2.1.3 и 2.1.4.

2.1.1. Окулярная сетка (окуляр-микрометр]

Простейший способ нанести шкалу — это выгравировать серию делений на круглой стеклянной пластинке, называемой окулярной сеткой. Окулярная сетка монтируется в микроскопе так, что нанесенная на нее шкала видна в фокусе одновременно с изображением. Обычно стекло с сеткой лежит на диафрагме окуляра, т. е. в его фокальной плоскости, совпадающей с плоскостью создаваемого объективом первичного изображения. Поскольку плоскость диафрагмы окуляра сопряжена с плоскостью препарата, то сетка, таким образом, автоматически оказывается в фокусе вместе с изображением препарата. Размер стекла с сеткой определяется внутренним размером тубуса окуляра. Стандартные сетки имеют диаметр 16, 19 или 21 мм, сетки других размеров поставляются по специальному заказу. В более дорогих устройствах сетки расположены в виде сэндвича между двумя стеклами. Преимуществом такой конструкции является то, что любая пыль или повреждение на поверхности сетки оказываются не в фокусе, когда он наведен точно на сетку. Более низкую стоимость имеют сетки, которые прикреплены или нанесены на нижнюю поверхность стеклянного диска так, чтобы они правильно читались.

Если при установке стеклянного диска в окуляр изображение шкалы оказывается не совсем резким, его можно сфокусировать, слегка отворачивая верхнюю линзу окуляра. Более удачное решение этой проблемы состоит в том, чтобы вставить измерительную шкалу в фокусируемый окуляр (такой, где предусмотрено значительное перемещение глазной линзы), что позволит всегда уверенно наводить на нее фокус. Такой окуляр называют обычно «измерительным окуляром» (рис. 7.1).

Наносимые на окулярные сетки шкалы могут иметь различный вид (рис. 7.2). Основу их чаще всего составляет горизонтальная или вертикальная линия, на которую нанесено различное число делений. Существуют также шкалы с перекрестьями или сеточками. Они используются для специальных целей, например для того, чтобы замечать определенную точку в изображении или делить поле зрения на маленькие части для упрощения подсчета частиц. Типичная окулярная шкала представляет собой линию длиной 10 мм, разделенную на 10 больших делений (по 1 мм), каждое из которых разделено на 10 маленьких делений. Важно помнить, что видимые размеры делений окуляр-микрометра не имеют прямого отношения к истинным размерам деталей препарата, находящегося в поле зрения. Калибровка окуляр-микрометра различается для каждого объектива, она зависит от длины тубуса микроскопа и разведения бинокулярной насадки для глаз. По этой причине необходимо калибровать окуляр-микрометр для каждого объектива микроскопа. Если такая калибровка однажды сделана (с помощью объект-микрометра), то она сохраняет свое значение до тех пор, пока вы работаете с тем же объективом, тубусным расстоянием микроскопа и межзрачковым расстоянием

132

бинокулярной насадки.

Калибровочная шкала, или, как ее часто называют, объект-микрометр, представляет собой предметное стекло стандартных размеров с точно нанесенной на него шкалой. Эти шкалы могут быть различными, но обычно они имеют длину 1 мм и разделены на 100 делений по 10 мкм каждое. Другие варианты объектмикрометров для использования при работе с малыми увеличениями имеют длину шкалы 2, 5 или даже 10 мм с соответственно более крупными делениями. Объект-микрометры можно использовать при исследованиях в проходящем и падающем свете. С помощью окуляр-микрометра нельзя достичь большой точности измерений, которая лимитируется точностью изготовления шкалы и, что более существенно, способностью наблюдателя прочесть показания шкалы на краях измеряемого объекта. Тем не менее, данная процедура требует очень мало оборудования, легко выполнима и в большинстве случаев дает удовлетворительные результаты. Метод калибровки окуляр-микрометра приведен в разд. 2.1.5.

Рис. 7.1. Окуляр-микрометр. Окуляр содержит шкалу, на которую производится фокусировка перемещением подвижной части тубуса, содержащей глазную линзу (на рисунке слева). Нанесенные по окружности тубуса деления указывают на его нормальное положение. Обратите внимание на фиксирующее кольцо с насечкой для фиксации подвижной части тубуса.

Рис. 7.2. Схемы некоторых выпускаемых окулярных шкал. А и Б — горизонтальные и вертикальные микрометрические линейки. В — скрещенный микрометр; Г — шаговый микрометр; Д — сетка из квадратиков; Е — перекрестье; Ж — квадраты; 3 — половинный транспортир, калиброванный в градусах.

2.1.2. Микрометр с волоском, или винтовой микрометр

(Окуляр-микрометр с волоском, который иногда называют винтовым окуляр-микрометром, позволяет производить измерения быстрее, чем при помощи простого окуляр-микрометра со шкалой. Он, кроме того, более прост в обращении. Окуляр-микрометр с волоском (рис. 7.3,Л) имеет подвижную нить (которую часто называют опорной линией), расположенную в фокальной плоскости. При вращении винта с помощью наружного барабана нить движется в окуляре поперек поля зрения. На барабане имеется шкала, так что его перемещения могут быть точно измерены. В некоторых окуляр-микрометрах с волоском есть фиксированная линия, которая служит точкой отсчета,— к ней подводят один край измеряемого объекта. Если имеется только опорная линия, то при проведении измерений ее следует сначала подвести к одному краю объекта, а затем к другому. Показания барабана снимают при каждом положении нити и по разности между этими величинами, когда окуляр прокалиброван с помощью объект-микрометра, можно определить размеры объекта в препарате.

Некоторые фирмы выпускают другой вариант винтового окуляра, известный как окуляр с занавесом, который очень прост в употреблении. В нем тонкая опорная линия отсутствует. Вместо нее с одной стороны поля зрения располагается область, где изображение выглядит более темным. При вращении барабана другая темная область (или занавеска) появляется с другой стороны поля зрения и достигает стационарной занавески.

133

Границы занавесок используются как метки, охватывающие объект точно также, как перемещающиеся опорные линии.

Рис. 7.3. А. Окуляр-микрометр с нитью. Расположенное в верхней части кольцо с накаткой служит для фокусировки опорных линий. Справа — барабан с градуировкой, служащий для контроля перемещения одной из линий. Б. Окуляр-микрометр сдвига. Внизу видна глазная линза, справа от домика — ручной счетчик и перемещающий изображение барабан. Счетчик передвигается на одну единицу при перемещении барабана на каждое деление после нуля. Нанесенные на счетчике деления позволяют определять цену одного деления, относящегося к перемещению барабана.

2.1.3. Окуляр-микрометр сдвига

Этот вид окуляра (рис. 7.3,Б), впервые созданный Ватсонсом (Watsons), а позднее Виккерсом (Vickers), дает возможность измерять микроскопические объекты с точностью, в 10 раз более высокой, чем та, которую обеспечивает стандартный окуляр-микрометр. Хотя в настоящее время данный окуляр уже не выпускается, тем не менее, во многих лабораториях еще хранятся окуляр-микрометры сдвига. Принцип их работы состоит в расщеплении микроскопического изображения на два, которые затем могут быть разведены или сведены на различные измеряемые расстояния (рис. 7.4). Данный сдвиг осуществляется внутри окуляра вращением призм в вертикальной плоскости относительно средней оси или вращением двух зеркал, установленных в каретке. Два разделенных изображения окрашены, одно в красный, другое в зеленый цвет, что позволяет очень точно определять величину сдвига. В точке совмещения можно видеть нормальное изображение, а при вращении ручки оно расщепляется на два. Когда два изображения соприкасаются, в области перекрывания появляется контрастная темная линия (рис. 7.4). Данная система позволяет очень точно совмещать края (чем и определяется точность измерений), причем объект не требуется двигать для совмещения с опорной или подвижной линией. Кроме того, смещенными в поле зрения оказываются все объекты, так что, производя установку для одного объекта, можно сразу же определить относительно него величину других объектов. При работе окуляр-микрометра сдвига результаты обычно считываются со шкалы ручного счетчика, хотя иногда у него имеется верньер для более точной установки величины сдвига. Как и все окуляр-микрометры, окулярмикрометр сдвига должен быть откалиброван с помощью объект-микрометра. Это делается следующим образом. Выбирают подходящее число делений (например, десять), которые сдвигают в одну сторону, в результате чего их изображения перекрываются так, что изображение первой линии попадает на изображение десятой линии. Отмечают показания счетчика. Затем поворачивают контрольную рукоятку так, чтобы изображения такого же числа линий совместились в обратном порядке, и вновь отмечают показания счетчика. Половина разности между первым и вторым показаниями счетчика дает величину сдвига для выбранного числа делений. Отсюда можно рассчитать величину сдвига, приходящуюся на единицу шкалы счетчика. Аналогичный прием используется при измерении объектов: берутся два последовательных показания счетчика при сдвигах, когда изображение объекта полностью разделено в одном, а затем в противоположном направлении. Разность показаний делится на два и умножается на откалиброванную цену деления счетчика, что дает искомые размеры. При другом способе измерений можно брать последовательно показания счетчика в положениях, когда два изображения объекта полностью совпадают (нулевой сдвиг) и полностью разделены в одном направлении. В этом случае размер объекта просто равен разности показаний счетчика, умноженной на цену его деления. С любым окуляр-микрометром сдвига оператор быстро научится определять положение нулевого сдвига, так что второй метод, требующий только одного сдвига изображений в окуляре до полного их расхождения, окажется более быстрым, хотя и менее точным, чем метод двойного сдвига.

134

Рис. 7.4. Схема, иллюстрирующая действие окуляр-микрометра сдвига. 4 — картина, которая видна при совмещенных изображениях.

1—3 — сдвиг изображений в одном направлении;

2 и 6 — изображения раздвинуты правильно; при данных положениях изображений следует считывать показания.

2.1.4. Другие методы измерения длины

Хотя наиболее часто применяются методы измерений, описанные в разд. 2.1.1 и 2.1.2, иногда возникает потребность в быстрых и относительно грубых измерениях. Если объект достаточно велик (и соответственно используется малое увеличение микроскопа), то можно проводить измерения, перемещая объект с помощью препаратоводителя на столике микроскопа и контролируя перемещения с помощью перекрестья в окуляре (рис. 7.2, Е]. Размеры объекта при этом определяются, исходя из положений шкалы и нониуса столика в начале и в конце перемещения. Данный метод обладает тем неудобством, что показания шкал механического столика часто бывает трудно сколько-нибудь точно прочесть, что приводит к ошибкам величиной до 100 мкм.

Можно также проводить измерения на спроецированном изображении объекта. Изображение можно спроецировать либо на специальную просмотровую насадку с экраном из матового стекла, либо на лист белой бумаги, приколотый к стене или к столу. Изображение объекта оказывается при этом достаточно увеличенным, так что его можно мерить обычной рулеткой, деления которой были предварительно откалиброваны по объектмикрометру, спроецированному с помощью той же оптики и при том же расстоянии проекции, что и объект. Преимуществом такого способа измерений является то, что изображение объекта намного больше, чем в окуляр-микрометре, и непосредственные измерения оказываются проще.

В настоящее время выпускается несколько электронных систем на основе телевидения, которые монтируются на микроскоп и позволяют производить точные измерения линейных размеров. В большинстве случаев измерительная шкала в них накладывается на телевизионное изображение препарата. Затем с помощью электронных средств управления размеры шкалы подгоняются к размерам интересующего вас объекта, величина которого выводится при этом непосредственно на цифровое устройство для чтения или на экран. Для начальной калибровки здесь, как и во всех измерительных системах, необходимо использовать стандартную шкалу. В некоторых более сложных приборах имеется система установки уровня серого для контуров объекта. В этом случае при проведении измерений прямоугольные рамки или курсоры можно более точно подвести к границам объекта благодаря тому, что для них устанавливается 50%-ный уровень между белым и черным. Другие приборы позволяют измерять прямоугольники (или круги) по заранее задаваемым пользователем отклонениям в уровнях яркости; они позволяют также проводить измерения углов и простейшие подсчеты клеток. Такие системы (например, Crystal, RMC-D3 или Portascan — разд. 6) очень удобны, когда нужно проводить много стандартных измерений и цена прибора (которая может достигать нескольких тысяч фунтов стерлингов) приемлема.

2.1.5. Калибровка и использование окуляр-микрометра с линейкой или окуляр-микрометра с подвижным волоском

Для калибровки рекомендуется следующая процедура.

1.Установите в микроскопе правильное освещение по Кёлеру, используя соответствующий объектив и контрастный препарат.

2.Замените препарат объект-микрометром и установите изображение его шкалы в поле зрения.

3.Возьмите окуляр-микрометр и наведите микроскоп на освещенное поле. Вращая фокусирующую оправу окуляра, наведите на резкость его шкалу. Следует избегать аккомодации глаза.

4.Замените окуляр на окуляр-микрометр и поверните последний так, чтобы установить шкалу параллельно

135

шкале объект-микрометра.

5.Установите шкалу в окуляре таким образом, чтобы на одном конце она совпадала со шкалой объектмикрометра (рис. 7.5): отметка «О» на сетке окуляр-микрометра совмещается с отметкой «О» в объектмикрометре.

6.Подсчитайте число делений в окуляр-микрометре между нулевой точкой совпадения и следующей удобной точкой совпадения шкал.

7.Рассчитайте цену деления окуляр-микрометра в микронах. В примере, приведенном на рис. 7.5, где нулевые точки окуляр-микрометра и объект-микрометра совпадают, 10 больших делений окуляр-микрометра (то есть 100 малых делений) соответствуют 1270 мкм на объект-микрометре. Таким образом, в нашем примере при данной комбинации объектива, длины тубуса и окуляра цена деления окуляр-микрометра составляет

1270/100, или 12,7 мкм.

Рис. 7.5. Схема, показывающая соотношение изображений объект- микоомет-ра (слева) и линейки окуляр-микрометр а (справа) в микроскопе Они совмещены в нулевом положении. Видно, что 10 делений окуляр-микрометра соответствуют фактическому расстоянию, как показывает объектмикрометр в 1270 мкм.

После калибровки можно измерять объекты, просто совмещая их изображения с изображением шкалы окуляр-микрометра и подсчитывая число делений, которое на них приходится, а затем умножая его на калибровочный фактор (в нашем примере 12,7 мкм) — это и даст их размеры в мкм.

Если у вас имеется микроскоп старой модели с приспособленным для рисовальной насадки монокулярным тубусом, то, прежде чем проводить калибровку, необходимо установить тубус на длину 160 мм. Нужно специально следить, чтобы в процессе работы длина тубуса оставалась неизменной, так как ее изменение скажется на увеличении конечного изображения и сделает неправильными любые измерения. Хотя объективы скорректированы так, чтобы наилучшее изображение получалось при использовании в рисовальной насадке тубуса длиной 160мм, тем не менее можно несколько изменить длину тубуса, с тем чтобы при калибровке окуляр-микрометра получить целые значения цены деления. После такой процедуры необходимо отметить точное положение тубуса, для того чтобы воспроизводить его при последующих измерениях.

Процедура калибровки для микрометра с волоском в точности та же, за исключением того, что вначале необходимо выставить опорную линию и прочитать показания на барабане. Затем, вращая барабан, передвигают подвижный волосок в окуляре по изображению объект-микрометра так, чтобы по отношению к нему он встал в какое-нибудь удобное положение. Следует продвинуть его достаточно далеко от начальной точки, так как, чем больше пройденное волоском расстояние, тем выше точность калибровки. После того, как опорная линия точно идентифицирована во втором положении, показания барабана считывают снова и

136