4.2.3. Ограничения конденсоров темного поля высокого разрешения

В некоторых случаях при работе с темнопольными конденсорами и заранее приготовленными препаратами возникают трудности. Причина, как уже должно быть ясно читателю, состоит в том, что расстояние до вершины конуса падающего света слишком мало для того, чтобы эта вершина могла оказаться внутри образца, который смонтирован на толстом стекле. В такой ситуации не остается ничего другого, как поискать относительно редкий тип фокусируемого темнопольного конденсора. В противном случае придется перезаключать препарат, используя более тонкое предметное стекло.

Другое ограничение метода темнопольной микроскопии состоит в том, что в поле зрения оказывается слишком много деталей, таких, как пузырьки воздуха или инородные частицы, которые ухудшают изображение. Таким образом, данный метод лучше всего использовать для изучения мелких дискретных структур, достаточно удаленных друг от друга.

4.3. Темнопольное изображение

Темнопольное изображение создается рассеянным светом и, таким образом, представляет собой карту изменений коэффициента преломления и других светорассеивающих параметров препарата.

Рис. 2.2. Роль света нулевого порядка в формировании изображения: изображение P. angulatum в темном поле. А. З.ф.п. объектива с NA 1,3 при открытой диафрагме, когда яркий свет нулевого порядка участвует в формировании изображения. Б. Тот же объектив, что и в Л, но диафрагма закрыта, что исключает свет нулевого порядка. Обратите внимание на дифракционный спектр первого порядка, который имеет вид пересекающихся полукружий. В. Изображение, получающееся при установке света, как в случае Л. Детали разрешены, но трудно различимы. Г. Изображение, получающееся при установке света, как в случае Б. Детали вновь разрешены, но видны значительно лучше, чем в В. Заметьте, что детали разрешены и в A, и в Б но видны гораздо лучше в Б. Увеличение на В и Г Х900.

5. Поляризованный свет

Данный раздел познакомит вас с методами получения контраста, основанными на поляризации света. Однако его не следует рассматривать как введение в кристаллографию.

Световые волны колеблются во всех направлениях, перпендикулярных оси распространения луча. Плоскополяризованный свет представляет собой такой свет, колебания в котором происходят только в одной плоскости, перпендикулярной направлению распространения луча. Такой свет можно получить, отфильтровав от обычного света все колебания, за исключением происходящих вдоль одного разрешенного направления.

Таблица 2.9. Плеохроизм

1.Поместив поляризатор в ход лучей перед препаратом, получите плоскополяризованный свет.

2.Глядя на большинство образцов, освещенных таким образом, вы вряд ли заметите большие различия, если не считать некоторого снижения интенсивности света. Это происходит потому, что большинство биологических препаратов пропускают свет одинаково, вне зависимости от направления плоскости его колебаний. Такие материалы называются изотропными.

3.Поверните препарат, а если это невозможно — поверните поляризатор. Если препарат изотропный, то никаких изменений в интенсивности света или в окраске его в результате вращения не произойдет.

4.Если возможно, исследуйте пластинку слюды, достаточно тонкую для того, чтобы она была прозрачной (очень подходящим является также геологический шлиф турмалинового кварца). Вращайте препарат, как указано выше, и при этом отметьте изменения цвета каких-либо линейных структур в препарате (разд. 5.1).

27

Таблица 2.10. Проверка скрещения поляризаторов

1.Установите в микроскопе обычным образом освещение по Кёлеру.

2.Вставьте поляризатор.

3.Уберите препарат.

4.Поместите второй кусочек поляризатора поверх окуляра.

5.Вращая второй поляризатор, который теперь называется анализатором, добейтесь минимальной интенсивности света. Данное конкретное расположение поляризаторов является скрещенным. Отметьте каким-либо способом их относительное расположение и, если возможно, установите таким образом, чтобы разрешенная плоскость колебаний поляризатора была ориентирована в направлении восток — запад.

Для этих целей вполне подходит поляроид, который дает достаточное качество поляризации света для большинства приводимых здесь упражнений. В табл. 1.4 приведен метод для определения разрешенного направления колебаний в куске поляроида.

Некоторые простые упражнения, приведенные в табл. 2.9— 2.12, позволят вам понять на практике, как поляризованный -свет взаимодействует с веществом и как это взаимодействие может быть использовано для достижения контраста в световой микроскопии.

5.1. Использование одиночного поляризатора

Техника получения контраста при использовании плоскополяризованного света приводится в табл. 2.9 под заголовком «Плеохроизм».

Из табл. 2.9 вы можете видеть, что частичка слюды при одной ориентации будет слегка серой, а повернутая под прямым углом — темно-желтой.

Рис. 2.3. Получение контраста в микроскопии с помощью поляризованного света. Одиночный поляризатор и плеохроизм: А — молекула конго-рот и Б — молекула метиленового синего (стрелками указано направление колебаний света, вдоль которого поглощение света велико). Размеры даны в нм. Скрещенные поляризаторы и двулучепреломление: В — стержни (nr) и Г — пластинки (ni), лежащие в среде (nm), Д — изменение величины двулучепреломления (nε - nω) ПРИ изменении показателя преломления среды (nm), как в В и Г. Линии соответствуют: 1—положительной форме двулучепреломления; 2— положительной форме двулучепреломления и положительному двулучепреломлению на кристалле; 3 — отрицательной форме двулучепреломления и положительному двулучепреломлению на кристалле. Е. Отрицательный сферический крест. Ж. Положительный сферический крест с соответствующей эллипсоидальностью. 3. Зерно картофельного крахмала между скрещенными поляризаторами и при использовании чувствительной пластинки (ST — медленная ось пластинки). Видно, что дополнительное синее окрашивание (с) располагается параллельно ST, тогда как вычитаемое желтое окрашивание (ж) располагается под прямым углом к ней. Заметьте также, что изогиры не параллельны ни анализатору (линия АА), ни поляризатору (линия РР). Рисунки А и Б воспроизводятся из работы [6] с разрешения

Harvard University Press, а рисунки В—Ж — из работы [7] с разрешения Unwin Hyman.

Таблица 2.11. Исследование препарата между скрещенными поляризаторами для выявления контраста между двулучепреломляющими и изотропными областями

1.Установите в микроскопе освещение по Кёлеру.

2.Установите поляризатор в известном положении.

3.Положите несколько зерен картофельного крахмала в воду, накройте покровным стеклом и рассмотрите. За исключением контуров зерен вы вряд ли что-нибудь увидите. Некоторое повышение контраста может быть достигнуто путем опускания конденсора, при этом могут быть видны ядро и пористая структура. Вы можете убедиться в неадекватности использования освещения узким пучком света.

4.Установите анализатор, и вы увидите, что освещение фона сразу же упадет практически до нуля. Зерна крахмала, однако, будут сравнительно яркими, и в каждом из них будет видно нечто

28