10.Методы окраски срезов и заключение их под покровное стекло.

Употребляемые в гистологической технике краски делятся на 4 группы:

1. Кислые (фоновые, протоплазматические) краски, например, эозин, фуксин кислый, пикриновая кислота, отсюда и термин оксифилия – любящий кислоту, так как некоторые тканевые элементы воспринимают или окрашиваются только кислыми красителями.

2. Основные (ядерные), например, гематоксилин.

3. Нейтральные, например, метиленблау, нейтраль-рот (нейтрофилия).

4. Специальные, например, судан III и др.

Процесс окраски заключается в обработке среза в красящих растворах, контрастных по цвету и различных по химическому характеру.

Эозин (кислая краска красного цвета) реагирует со щелочной протоплазмой (оксифилия).

Гематоксилин (краска с щелочной реакцией лилового цвета) реагирует с кислым ядром (базофилия).

Метахромазия – такое явление, когда краска окрашивает ткань в другой цвет, нежели она сама. Например, тионин, муцикармин и др. являются красками синего цвета, а слизь окрашивают в красный цвет.

Способы окраски

1. Гематоксилин-эозин – обязательная ориентировочная окраска.

2. Дополнительные методы окраски, например, на соединительную ткань, жир, гемосидерин, эластику и т.д.

Следует помнить, что на качество окраски влияют способ фиксации, а также предварительная и последующая обработка препарата.

Красящие растворы должны быть чистыми, для чего любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровывать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде. Окрашивать лучше красками низкой концентрации в течение длительного времени. Лучше срезы перекрашивать, а затем доводить до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо видеть определенные элементы тканей. Окраска должна вестись под контролем микроскопа.

Окраска срезов гематоксилин-эозином

А. Необходимые материалы

1. Гематоксилин. Эту краску получают из коры кампешевого дерева, красящим веществом является продукт его окисления – гематеин (С16Н12O6).

2. Существует много рецептов окисления гематоксилина: например, квасцовый гематоксилин (гемалаун) Майера, железный гематоксилин Вейгерта, гематоксилин Эрлиха и т.д.

Гемалаун Майера:гематоксилина – 1,0,квасцов калийных – 50,0,йодноватокислого калия – 0,2,воды дистиллированной – 1000,0.

Гематоксилин Вейгерта:

I. 1%-ный раствор гематоксилина в спирте.

II. Полуторахлористого железа – 4 см3,соляной кислоты – 1 см3,воды дистиллированной – 95 см3.

Оба раствора приготовляют отдельно, смешивают перед употреблением в равных объемах.

Примечания.

1. 50%-ный раствор водного хлорного железа FeCl3 • 6Н2О – желто-бурая масса

2. Соляная кислота – 1%-ный водный или спиртовой раствор.

3. Эозин (анилиновая краска) – 0,1-1%-ный водный или спиртовой раствор.

Б. Ход окраски

Гематоксилин → Вода водопровод. → 1% НСl 0,5-1 мин. →

3-5 мин 0,5-1 мин до появления

розового цвета

→ Вода водопровод. → Эозин → Вода дистиллированная

0,5-1 мин 3-5 мин 0,5-1 мин

В. Результаты окраски:

1) ядра лиловые, синие,

2) цитоплазма клеток – различные тона красного цвета.

Заключение срезов под покровное стекло в пихтовый бальзам

Пихтовый бальзам представляет собой очищенную смолу хвойных деревьев. Она применяется для заделки окрашенных срезов под покровное стекло, потому что коэффициент преломления света бальзама одинаков с коэффициентом преломления света стекла.

Смола не смешивается с водой, поэтому окрашенный срез проводят через спирт для обезвоживания, карбол – ксилол (1 : 3) для удаления спирта и просветления, ксилол как растворитель пихтового бальзама (рис. 11).

Схема заключения в бальзам

1. Спирт 1 мин → карбол-ксилол 1 мин → ксилол 1 мин.

2. Срез извлекают из ксилола на предметное стекло.

3. На срез наносится капля бальзама и покрывается покровным стеклом

Окраска срезов на соединительную ткань по Ван-Гизону

А. Материалы

1. Гематоксилин Вейгерта.

2. Пикрофуксиновая смесь Ван-Гизон*: пикриновой кислоты (насыщенный водный раствор) – 100,0, фуксина кислого (1% водный раствор) – 10,0

Примечание. * При комнатной температуре в 100 мл дистиллированной воды растворяется около 1,2 г пикриновой кислоты.

Б. Ход окраски

Гематоксилин → Вода → Смесь Ван-Гизон → Вода дистиллированная →

1-3 мин 1 мин 5-10 мин 1 мин

→ Спирт → Карбол – ксилол → Ксилол

1 мин 1 мин 1 мин

→ Заключение в бальзам.

В. Результаты окраски: коллагеновые волокна соединительной ткани красного цвета протоплазма клеток и эритроциты желтого цвета; ядра лилового или коричневого цвета.

Окраска замороженных срезов для выявления жира суданом III

А. Необходимые материалы

1. Судан III

Рецепт: спирта 70° – 100 см3

Судана III – 0,3 г.

Кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают, фильтруют.

2. Гематоксилин Майера и Вейгерта.

3. 1%-ный раствор соляной кислоты.

4. 50%-ный раствор глицерина для заключения срезов под покровное стекло.

Б. Ход окраски

Спирт 50° → Судан III → Спирт 50° → Вода → Гематоксилин →

1-2 мин 3-20 мин 0,5-1 мин ополоснуть 2-3 с

Вода → соляная кислота → Вода →

2-3 мин 2-3 мин 1-2 мин

→ Срезы заключают в глицерин под покровное стекло.

В. Результаты окраски: жир оранжево-красного цвета; ядра синие, лиловые; протоплазма бесцветная.

Очень хорошие результаты для выявления жира получают при окраске щелочным суданом по Герксгеймеру:

спирт абсолютный (или 96°) – 70 мл.

10%-ный раствор едкого натра – 20 мл,

дистиллированная вода – 10 мл.

судан III или IV – 0,25 – 1,6 г.

Кипятят в течение нескольких минут на водяной бане. Окраска 3-5 мин.

Гистохимическая реакция гемосидерина в тканях по Перлсу

А. Необходимые материалы

1.СмесьПерлса:

1%-ный раствор: желтой кровяной соли (железисто-синеродистого калия) – 2 г,

воды дистиллированной – 100,0 см3,

2%-ный раствор: соляной кислоты – 1 см3,

воды дистиллированной – 100 см3.

Оба раствора смешивают в пропорциях 1:1,5 перед употреблением.

2. Кармин Гренахера:

кармина – 1,0,

квасцов калийных – 5,0,

воды дисташшрованной – 100 см3.

Кипятят 20 мин, после охлаждения фильтруют.

Б. Ход окраски

Смесь Перлса → Вода → Кармин → Вода →

5-10мин 1 мин 5-10 мин 1 мин

→ Заключение среза в пихтовый бальзам (спирт, карбол-ксилол, ксилол)

Примечание. Работа производится стеклянными иглами.

Результаты окраски: гемосидерин сине-голубого цвета, ядра темно-красные, протоплазма розовая.