7) Подготовка патматериала к микротомированию.

Вся подготовка складывается из:

1. Удаления извести (декальцинации) в исследуемом кусочке.

2. Уплотнения кусочков органов и тканей при помощи плотных прозрачных сред (целлоидина, парафина, желатина и др.).

1. Декальцинацией называется удаление извести из материала. Кости и обызвествленные ткани фиксируют по общим правилам.

Все методы декальцинации основаны на растворении извести в слабых растворах кислот. Кислота, в свою очередь, нейтрализуется слабыми щелочными растворами.

1. Декальцинирующие жидкости:

А) Азотная кислота – 3-10%:

азотной кислоты – 3-10 см3,

дистиллированной воды – 97-90 см3.

Б) Жидкость Эбнера:

4%-ного раствора соляной кислоты – 100,0,

насыщенного раствора поваренной соли – 100,0.

В) Трихлоруксусная кислота – 5-10 %:

трихлоруксусной кислоты – 5-10 см3,

дистиллированной воды – 95-90 см3.

2. Материал помещается в декальцинирующую жидкость, объем которой в 25-50 раз должен превышать объем взятого кусочка.

3. Декальцинируемые объекты должны со всех сторон омываться растворами кислот, для этого их подвешивают к крышке банки или на дно ее кладут кусок марли или ваты и на нее помещают исследуемые объекты.

4. Декальцинирующую жидкость меняют каждые 24-48 ч.

5. Окончание декальцинации определяется возможностью произвести надрез или прокол всего кусочка.

6. Нейтрализация кислоты в течение 24 ч в одной из следующих жидкостей:

- 5%-ный водный раствор калийных квасцов;

- 5%-ный водный раствор сернистого лития;

- насыщенный раствор углекислого лития.

7. Промывка в проточной воде 24 ч.

8. Уплотнение в 20%-ном водном растворе формалина – 24 ч.

Примечания.

1. Всякие работы с кислотами проводят в вытяжном шкафу, в котором следует сохранять и исходные, т.е. неразбавленные кислоты.

2. При использовании трихлоруксусной кислоты промывка материала в воде не допускается. Промывают в 96° спирте 3-4 дня при ежедневной смене.

2. Уплотнение исследуемых кусочков

Заливка материала в плотные среды необходима:

1) для гомогенизации (однородности) обрабатываемого материала;

2) для скрепления («цементирования») тканевых элементов материала.

Традиционными способами уплотнения материала являются лед, целлоидин, парафин и желатина.Лед в качестве плотной среды применяют при работе на замораживающем микротоме.

8) Порядок заливки пат материала в парафин.

Парафин представляет собой смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемых при обработке нефти и угля.

Свойства парафина:

1) прозрачность;

2) растворяется только в органических растворителях (ксилол, толуол, бензол, хлороформ);

3) плавкость.

Плавкость различных сортов парафина неодинакова. Точка плавления парафина обычно находится между 27 и 62°С. Выбор плавкости употребляемого парафина связан с температурой окружающей среды. В жаркое время года употребляют тугоплавкие сорта парафина (52°С). В холодных местностях и в холодное время года употребляются легкоплавкие сорта парафина (48°С).

Нужная плавкость достигается путем смешения тугоплавких сортов с легкоплавкими сортами парафина, причем лучше использовать аморфные сорта парафина. Кристаллические сорта его необходимо гомогенизировать путем кипячения в воде не менее 1 ч и многократными плавлениями, не допуская наличия остатков воды и воздуха в парафине. Для придания лучшей пластичности парафину необходимо добавить (до 5%) пчелиный воск.

А. Необходимые материалы

1. Спирт-ректификат 50,70 и 96°, абсолютный 96°

2. Спирт-ксилол (смесь равных частей).

3. Ксилол.

4. Ксилол-парафин (насыщенный раствор при 37°С).

5. Парафин с точкой плавления 42-52°С.

Смесь спирт-ксилол является промежуточной средой между обезвоживанием и собственно заключением, так как ксилол (хлороформ и др.) хорошо смешивается со спиртом и в то же время растворяет парафин. (Ксилол и толуол – кровяные яды, необходимо работать осторожно).

Б. Порядок заливки в парафин

1.Спирт50° – 1-2суток.

2. Спирт 75° – 1-2 суток.

3. Спирт 96° – 1-2 суток.

4. Спирт абсолютный – 1-2 суток.

5. Спирт – ксилол – 2-3 ч.

6. Ксилол – 2-3 ч.

7. Ксилол – парафин – 2-3 ч при 42-52°С в термостате.

8. Парафин – 4-6 ч (в термостате).

9. Парафин (свежая порция) – 4-6 ч при 42-52°С в термостате.

В. Кусочек помещают в бумажную ванночку, заливают расплавленным парафином и быстро охлаждают в холодной воде. Затем парафиновые блоки наклеивают на деревянные колодки при помощи горячего шпателя и оплавляют со всех сторон для лучшего сцепления. Парафиновые блоки не должны выступать за края деревянной колодки.

Г. Блоки хранятся в сухом виде.

Достоинства метода заливки в парафин

1. Относительная быстрота.

2. Возможность приготовления тонких (1-2 мкм) и серийных срезов

Недостатки

1. Некоторое уменьшение объема материала (8-20 %).

2. Необходимость подвергать материал действию относительно высокой температуры.