Молекулярная биология клетки Глава 3

31

Рис. 3-15. Гибридизация IN SITU. РНК-зонд связывается с комплементарным участком мРНК в исследуемых клетках. Визуализация связанного с меткой РНК-зонда указывает на экспрессию гена-мишени в данных клетках.

•выявления маркёрных генов опухолевых клеток;

•выявления ДНК или РНК в инфицированной ткани (например, при вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной инфекции);

•выявления мутированных генов при наследственных заболеваниях.

2. Протокол хромогенной гибридизации IN SITU

•Подготовка биопсийного материала нацеленасохранение как морфологической целостности ткани, так и ДНКили РНК-мишеней. На практике для гибридизации in situ готовят криостатаные срезы из замороженной ткани или парафиновые срезы из фиксированной формалином и пропитанной парафином ткани.

•Подготовкасрезовк гибридизациизаключается вдемаскировке нуклеиновых кислот. Для демаскировки нуклеиновых кислот проводят ограниченный протеолиз с использованием обычно двух фермен-

32

тов: протеиназы К и пепсин-HCl. Протеиназу применяют наиболее часто для демаскировки вирусной ДНК, а пепсин-HCl более подходит для анализа РНК и геномной ДНК.

•Выбор зонда. Для выявления генетических мутаций в хромосомах применяется ДНК-зонд — фрагменты одноцепочечной ДНК длиной около 20 нуклеотидов, конъюгированные с биотином.

•Денатурация. Перед гибридизацией, нити двуцепочеченой молекулы ДНК необходимо разделить друг от друга. Это достигается путём нагревания срезов до +95 °С — +98 °С. Время денатурации для замороженных срезов составляет 3-5 мин., а для парафиновых - 6 -10 мин. Во время денатурации срезы необходимо накрыть покровным стеклом для предупреждения высыхания.

•Гибридизация с ДНК-зондом проводится при +37С в течение 2-3 ч.

•Отмывка срезов после гибридизации проводится для удаления ДНК-зонда, не связавшегося с ДНК-мишенью.

•Визуализация реакции. Для детекции биотонилированных ДНКзондов срезы инкубируют со стрептавидином, конъюгированным с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). В результате гистохимической реакции (выявление активности фермента) в присутствии хромогенного субстрата (диаминобензидина) в месте реакции гибридизации образуется нерастворимый преципитат.

•Окрашивание препарата гистологическими красителями. Для получения полной морфологической картины ткани, после гибридизации срезы докрашивают стандартными гистологическими красителями, например гематоксилином и эозином.

•Заключение препарата. Срезы промывают и заключают в водорастворимые среды или канадский бальзам.

•Интерпретация результатов. Микропрепараты изучают под световым микроскопом. Гибридизационный сигнал представляет собой скопление зёрен коричневого цвета, локализованных в ядре.

3. IN SITU хромогенная гибридизация протоонкогена ERBB2 в эпителиальных клетках молочной железы

Виден проток молочной железы, выстланный нормальным эпителием. В результате комплементарного взаимодействия ДНК-зонда с геном erbb2 на 17 хромосоме в ядрах эпителиальных клеток чётко определяется продукт гибридизации коричневого цвета в виде двух точек (рис. 3-16). Наличие двух меток свидетельствует о присутствии в ядре клеток нормального количества аллелей этого гена — по одномуаллелю в каждой из двух гомологичных друг другу хромосом диплоидного набора.

33

Рис. 3-11. Гибридизация протоонкогена ERBB2 внормальных эпителиальных клетках протока молочной железы [с препарата проф. Петрова С.В.].

4. IN SITU хромогенная гибридизация онкогена ERBB2 в раковых клетках молочной железы

На препарате хорошо видны ядра клеток ракамолочной железы. Они округлой формы и слабо-фиолетового цвета. Вокруг ядер видна бесцветная цитоплазма с еле заметными контурами клеток. В каждом ядре опухолевой клетки видна коричневая зернистость (рис. 3-17). Количество зёрен равно количеству аллелей этого гена. Как правило, количество зёрен превышает норму, равную двум. Превышение числа аллелей сверх нормы свидетельствует о наличии в клетках хромосомных или геномных мутаций, сопровождающихся увеличением числа аллелей этого гена.

34

Рис. 3-17. Гибридизация протоонкогена ERBB2 в раковых клетках молочной железы [с препарата проф. Петрова С.В.].

35

ТИПОВЫЕТЕСТОВЫЕВОПРОСЫ

Пояснение. За каждым из перечисленных вопросов или незаконченных утверждений следуют обозначенные буквой ответы или завершения утверждений. Выберите один ответ или завершение утверждения, наиболее соответствующее каждому случаю.

(В)G2

2.На какой стадии митоза дочерние хромосомы расходятся к полю-

сам митотического веретена?

(В)Метафаза

3.Как называется тип стволовых клеток, которые обладают потенциалом дать началовсем специализированным клеткам, формирующим ткани эмбриона и обеспечивающим его развитие.

(А) Тотипотентные

(Б)Плюрипотентные

(В)Полипотентные

(Г) Унипотентные

(Д)Все из перечисленных

4.Назовите белок, который является одним из важнейших регуляторов клеточного цикла, специфически связывается с ДНК и активирует экспрессию генов,блокирующихцикл вконтрольной точке G1→S в случае возникновения нарушений репликации

ДНК.

(А) Белок р53

(Б) Циклины

(В) ras G-белки

(Г) Циклин-зависимые протеинкиназы

(Д)Белок семейства рецепторов эпидермального фактора роста

5.Каждая хромосома имеет особый участок, в области которого у большинства эукариот к хромосомам прикрепляются микротрубочки веретена деления. Назовите этот участок хромосомы.

(А) Короткое плечо

(Б) Длинное плечо

(В) Первичная перетяжка (центромера)

(Г) Вторичная перетяжка

(Д)Теломера

36

Пояснение. Каждый из нижеприведённых вопросов содержит четыре варианта ответов, из которых правильными могут быть один или сразунесколько. Выберите:

A — если правильны ответы 1, 2 и 3 Б — если правильны ответы 1 и 3 В — если правильны ответы 2 и 4 Г — если правилен ответ 4

Д— если правильны ответы 1, 2, 3 и 4

6.В какой фазе клеточного цикла происходит синтез РНК и белка?

(1)G1

(2)M

(3)G2

(4)S

7.Однимиз важнейших компонентов митотического аппарата эукариотической клетки является веретено деления, состоящее из:

(1)миозиновых нитей

(2)микротрубочек

(3)актиновых нитей

(4)моторных белков

8.Для ядра соматические клетки в предсинтетической стадии интерфазы характерно:

(1)диплоидный набор хромосом

(2)ядрышко

(3)рибосомы на наружной мембране ядерной оболочки

(4)каждая хромосома состоит из одной конденсированной хроматиды

9.Индуцированные плюрипотентные клетки:

(1)имеют характеристики эмбриональных стволовых клеток

(2)дают начало клеткам всех трёх зародышевых листков

(3)получают при помощи генетической модификации соматических клеток

(4)для модификации требуются факторы транскрипции

10.Сверочные точки находятся:

(1)G1→S

(2)S→G0

(3)G2→М

(4)М→G1

Ответы к тестовым вопрсам

1 – Г, 2 – Г, 3 – А, 4 – А, 5 – В, 6 – Б, 7 – В, 8 – А, 9 – Д, 10 – Б

37

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Что такое клеточный цикл? Назовите стадии.

2.Что такое митотический цикл? Назовите стадии.

3.Какие процессы происходят в клетке во время пресинтетического периода интерфазы?

4.Какие процессы происходят в клетке во время синтетического периода интерфазы?

5.Какие процессы происходят в клетке во время постсинтетического периода интерфазы?

6.Что такое фаза пролиферативного покоя? Какие процессы происходят в клетке во время фазы полиферативного покоя?

7.В какую стадию митотического цикла клетки происходит репликация ДНК?

8.Как называется точка начала репликации?

9.Как происходит образование репликативной вилки?

10.Как называется фермент, который синтезирует лидирующую цепь ДНК во время репликации? В каком направлении происходит синтез отстающей цепи ДНК?

11.Что такое центромера?

12.Что такое кинетохор?Какова его функция?

13.Каковы функции теломерных участков хромосомы?

14.Какова роль теломеразы в старении клеток?

15.Какие процессы происходят в клетке во время профазы митоза?

16.Какие процессы происходят в клетке во время прометафазы митоза?

17.Какие процессы происходят в клетке во время метафазы митоза?

18.Какие процессы происходят в клетке во время анафазы митоза?

19.Какие процессы происходят в клетке во время телофазы митоза?

20.К чему приводят мутации ras G-белка?

21.Что такое геликаза?

22.Назовите нетипичные формы митоза.

23.Как называется вид деления клеток, который сопровождается удвоением числа хромосом внутри ядерной оболочки без разрушения ядрышка и образования веретена деления?

24.Назовите клетки, в которых в норме происходит нетипичный митоз?

25.Что такое клеточный тип?

26.Что такое терминальная дифференцировка клетки?

27.Что такое пластичность клеточного типа и клеточный фенотип?

28.В каких процессах участвуют циклины?

29.Что такое индуцированные плюрипотентные клетки?

30.Как получают индуцированные плюрипотентные клетки?

38

31.При каком типе деления происходит кратное увеличение содержания ДНК в хромосомах при сохранении их диплоидного числа?

32.Какие хромосомы называются политенными? Как они образуются?

33.Что такое рецепторы смерти?

34.Какие внеклеточные молекулярные сигналы, стимулирующие клеточный цикл, Вы знаете?

35.Какой набор хромосом имеют дочерние клетки, образующиеся в результате митоза?

36.Что такое проапоптозные белки? Приведите примеры.

37.Что происходит в фазу G0?

38.Приведите пример прямой генной терапии, разрешённой в практической медицине.

39.К чему приводит мутация гена, кодирующего белок р53?

40.О чём свидетельствует снижение экспрессии гена, кодирующего белок р27?

41.Что происходит в точках рестрикции клеточного цикла?

42.Какова функция циклин-зависимых протеинкиназ?

43.Что такое апоптоз? Назовите несколько сигналов апоптоза.

44.Перечислите основные отличия некроза от апоптоза?

45.Какое биологическое значение имеет апоптоз?

46.Приведите примеры протоонкогенов. Какова их роль в злокачественной трансформации клеток?

47.Приведите примеры генов онкосупрессоров. Каков механизм их действия?

48.Чем обусловлена дифференцировка клеток?

49.Назовите типы стволовых клеток. Чем они отличаются?

50.Что такое ДНК-зонд?

39

СПРАВОЧНИК ТЕРМИНОВ

Аденин (6-амино пурин) — пуриновое основание; входит в состав РНК, ДНК нуклеотидов и играет важную роль в метаболизме

Азотистые основания — гетероциклические органические соединения, производные пиримидина и пурина, входящие в состав нуклеиновых кислот.

Амплификация — умножение количества копий участков хромосомной ДНК.

Анафаза — третья стадия, или фаза, митотического деления (митоза) растительной и животной клетки. Во время анафазы составляющие каждую хромосому хроматиды (или сестринские хромосомы) разъединяются и расходятся к противоположным полюсам клетки.

Антипараллельность цепей ДНК — противоположная направленность двух нитей двойной спирали ДНК; одна нить имеет направление от 5' к 3', другая — от 3' к 5'.

Апоптоз (от гр. apoptosis — опадание листьев) — программированная (регулируемая) гибель клеток путём деградации её компонентов (включая конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК) с последующим фагоцитозом макрофагами; а. наблюдается при морфогенезе органов, удалении аутореактивных клонов иммунокомпетентных клеток, регуляции численности пролиферирующих клеточных популяций, повреждении генома клеток. Контроль а. в клетках млекопитающих реализуется по двум путям. “Внешний” (рецепторный) путь запускает агонист рецептора смерти (например, Fas-лиганд, TNFα). Опосредованнаялигандомолигомеризация рецептора приводит к активации каспазы 8. “Внутренний” (митохондриальный) путь: большинство других проапоптозных стимулов инициирует активацию каспазы 9, что опосредует Apaf 1. Эти стимулы действуют на митохондрии, из которых выделяется цитохром c. Вместе с Apaf 1 и каспазой 9 цитохром с формирует комплекс активации (апоптосому). Каспаза 8 и каспаза 9 активируют эффекторныекаспазы (например, каспазу 3), которые участвуют в протеолизе и вызывают а. Аномально повышенная устойчивость (резистентность) клеток к а. значима в патогенезе пороков развития, аутоиммунных нарушений и злокачественных новообразований вследствие подавления процесса гибели дефектных и мутантных клеток (например, при аутоиммунном лимфопролиферативном синдроме угнетён а. лимфоцитов вследствие мутации гена, кодирующего гликопротеин Fas). Аномально повышенная гибель клеток путём а. сопровождает острые заболевания (инфекции, ишемические повреждения), а также ряд хронических патологий (нейродегенеративные заболевания, СПИД).

40

Апоптосома — молекулярный комплекс активации апоптоза, включает молекулуApaf 1, цитохром c, выделяющийся из митохондрий в ответ на действие проапоптозного сигнала, и каспазу 9.

Белки гистоновые (гистоны) — небольшие, сильно основные белки, связывающиеся непосредственно с ДНК. Гистоны принимают участие в структурной организации хроматина, нейтрализуя за счет положительных зарядов аминокислотных остатков отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК, что делает возможной плотную упаковку ДНК в ядре.

Белки негистоновые — группа высоко гетерогенных белков, включает структурные ядерные белки, множество ферментов и факторов транскрипции, связанных с определенными участками ДНК и осуществляющих регуляцию репликации, транскрипции, процессинга и других процессов.

Белок p27 связывается с циклином и Cdk и блокирует вхождение клетки в S фазуцикла. Определение р27 используют в диагностике рака молочной железы. Снижение уровня р27 является плохим прогностическим признаком.

Белокp53 —онкосупрессор,фактортранскрипции.Известентакжекак главный супрессор опухолей; активирует транскрипцию (связывается с последовательностьюТАТАДНК);избыточная экспрессиядикого типаp53 подавляет реализуемую разными промоторами транскрипцию, что приводит к блоку пролиферации клеток в фазе клеточного цикла G1 (в опухолях часто обнаруживаются аллели p53 в мутантной форме [пролиферацию не блокируют!]); при повреждении ДНК индуцируют гибель клеток (апоптоз); существует множество ассоциированных с p53 белков, посредством которых p53 участвует во многих клеточных процессах: подавляет клеточный цикл в фазе G1, репликациюДНК, спирализующую активность и пролиферацию опухолевых клеток. Опухоли (практически в 50%) сопровождаютсямутациямигенаp53. При этом, несмотряна возможные нарушения генома (включая изменения в количестве хромосом), клетки не входят в апоптоз и вступают в беспрерывный клеточный цикл. Репертуар мутаций гена p53довольно широк. Они приводятк бесконтрольномуразмножению клеток при раке толстой кишки, печени, лёгкого, пищевода, молочной железы, глиальныхопухоляхмозга, опухоляхлимфоидной системы.

Вегетативное размножение — способ бесполого размножения многоклеточных организмов с образованием новой особи из части тела родительского организма.

Веретено деления — структура, которая формируется в животных клетках в митозе. Состоит из микротрубочек и ассоциированных с ними белков.