Молекулярная биология клетки Глава 3

21

ствием экспрессии определённых генов, поэтомуапоптоз — генетически запрограммированная гибель клетки. Апоптоз индуцируется различными внеклеточными и внутриклеточными сигналами.

•Внеклеточными сигналами апоптоза могут быть специальные молекулы смерти (TNFα, FasL), которые взаимодействуют со своими рецепторами смерти (TNFR1, Fas/CD95), а также различные повреждающие факторы (облучение, стресс, действие фармакологических препаратов или вирусов). Апоптоз, опосредованный рецепторами смерти, инициируется сборкой смерть-индуцирующего сигнального комплекса DISC (Death-Inducing Signaling Complex), который контролирует активацию каспазного каскада (каспазы — ферменты, расщепляющие клеточные белки в ходе апоптоза) и деградацию ДНК. Проникшая в ядро каспаза-3 расщепляет неактивную форму ICAD (InactiveCaspase-ActivatedDNase). Отделившаяся от ICAD часть молекулы в виде CAD (Caspase-ActivatedDNase) «разрезает» ДНК между нуклеосомами.

•Апоптозные стимулы, возникающие в самой клетке, часто происходят из ядра вследствие повреждения ДНК при облучении, применении лекарств, стрессе. В большинстве случаев повреждение ДНК сопровождается активацией белка p53, который поддерживает экспрессию проапоптозных белков (Bax, Bak) и рецепторов смерти и угнетает экспрессию противоапоптозных белков (Bcl-2 и Bcl-XL). Проапоптозные белки способствуют образованию в мембране митохондрий пор, через которые из митохондрий в цитозоль выходят проапоптозные факторы (например, цитохром с), участвующие в сборке апоптосом (апоптосома — четвертичная белковая структура, платформа активации инициаторных каспаз) и последующей акти-

вации каспазного каскада.

Гибель клетки может наступить также путём некроза вследствие воздействия на организм внешних химических и физических факторов. Некроз — всегда патологическая ситуация.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Стволовыми клетками эмбриона, плода или взрослого организма считаются клетки, способные длительное время воспроизводить себе подобных и в течение жизни давать начало специализированным клеткам, образующим разные ткани организма. Совокупность этих признаков обозначают термином стволовость.

•Тотипотентная (лат. totus — целый, полный) клетка обладает потенциалом дать начало всем специализированным клеткам, формирую-

22

щим ткани эмбриона и обеспечивающим его развитие. Например, зигота и бластомеры по всем признакам относятся к тотипотентным клеткам.

•Плюрипотентные (лат. plures — несколько, много) клетки дифференцируются в разные полипотентные клетки всех трёх зародышевых листков — экто-, энто- и мезодермы. Клетки внутренней клеточной массы бластоцисты относятся к плюрипотентным клеткам.

Стволовые клетки взрослого организма выделены из красного кос-

тного мозга, периферической крови, пульпы зуба, спинного и головного мозга, кровеносныхсосудов, скелетной мышцы, эпителия кожи и пищеварительной системы, роговицы и сетчатки глаза, печени и поджелудочной железы. Это полипотентные клетки, потомки которых дают начало ограниченному количеству типов коммитированных (унипотентных) клеток-предшественниц. К настоящему времени плюрипотентная стволовая клетка взрослого организма, способная дать начало всем клеточным типам организма, не обнаружена.

•Эмбриональные стволовые клетки получают из бластоцисты на 4–5 сутки после оплодотворения яйцеклетки. Полученные клетки культивируют in vitro с целью выделения чистой клеточной линии, способной формировать шарообразные скопления — эмбриоидные тела. С помощью специфических факторов роста можно направлять дифференцировкудиссоциированных клеток эмбриоидных тел в различные клеточные типы всех трёх зародышевых листков.

•Индуцированныеплюрипотентныеклетки(inducedPluripotent Stemcells, iPS–cell)полученыпутёмгенетическоймодификациисоматическойклет- ки факторамитранскрипцииOct4, Sox2,cMyc иKlf4. Полученныеклетки обладают свойствами эмбриональныхстволовыхклеток. Вкультуре iPS–клеткиспонтанно дифференцируютсяв производныезародышевой эктодермы, энтодермыи мезодермы. В результатетрансплантации iPS– клеток вбластоцистумыши получены живыехимеры, способные генерировать половые клетки iPS происхождения.

23

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

I. МИКРОПРЕПАРАТЫ. ВИДЫ МИТОЗА

1. Фигуры митоза в опухолевых клетках человека

На микропрепарате можно видеть клетки, находящиеся на разных стадиях клеточного цикла и митоза (рис. 3-8).

Профаза. Стадия материнского клубка

При большом увеличении микроскопа среди неделящихся клеток с ядрами округлой или овальной формы найти клетку, ядро которой имеет вид клубка, состоящего из интенсивно окрашенных хроматиновых нитей. Происходит конденсация хромосом, состоящих из двух хроматид. Зарисовать делящуюся клеткуи отметить материнский клубок.

Метафаза. Стадия материнской звезды

При большом увеличении микроскопа найти клетку, находящуюся в стадии материнской звезды. Хромосомы, расположенные по экватору клетки, имеют вид шпилек, обращенных согнутыми концами к середине клетки, а свободными — к периферии. Каждая хромосома состоит из

Рис. 3-8. Фигуры митоза клетки человека

24

двух хроматид, соединенных друг с другом в области центромер. Зарисовать делящуюся клеткуи отметить материнскую звезду.

Анафаза. Стадия дочерних звёзд

При большом увеличении микроскопа найти клетку, находящуюся в стадии дочерних звёзд. Эту стадию можно узнать по двум небольшим фигурам в виде звёзд, состоящих из расцепившихся и отошедших друг от друга к противоположным полюсам клетки хромосом. При зарисовке следует обратить внимание на то, что согнутые концы хромосом обращены к полюсам, а свободные — к экваторуклетки. Зарисовать делящуюся клетку и отметить дочерние звёзды.

Телофаза. Стадия дочерних клубков

Среди клеток, находящихся в интерфазе, найти делящуюся клетку с двумя маленькими клубочками, состоящими из хроматиновых нитей. Зарисовать делящуюся клеткуи отметить дочерние клубочки.

2. Митоз в клетках корешка лука

Деление клеток происходит в самом кончике корешка лука. При большом увеличении найти делящиеся клетки с хроматиновыми фигурами митоза (рис. 3-9). Зарисовать клетки, находящиеся на различных стадиях деления и отметить интерфазу и фазы митоза.

3. Мазок красногокостного мозга

Дифференцировка эритроцита

Дифференцировкуэритроидного клеточного типа (эритропоэз) можно представить следующим образом (рис. 3-10): стволовая кроветворная клетка (CFU-blast) — источник всех клеток крови → полипотентная клетка-предшественница миелопоэза (CFU-GEMM) ограничена в потенциях и дифференцируется в клетки миелоидного ряда → взрывообразующая единица эритропоэза (BFU-E) даёт начало только клеткам эритроидного ряда → унипотентный предшественник эритроцитов (CFU- E) → проэритробласт → базофильный эритробласт → полихроматофильный эритробласт → нормобласт → ретикулоцит → эритроцит.

Эритробластный островок. Дифференцировка эритроцитов происходит в составе эритробластных островков. Островок состоит чаще всего из одного макрофага, окружённого клетками-предшественницами

25

Рис. 3-9. Митоз в клетках корешка лука

эритроцитов. Макрофаг образует отростки, на поверхности которых расположены делящиеся эритроидные клетки. По мере дифференцировки эритроидная клетка выталкивает ядро, которое фагоцитируется макрофагами; безъядерная клетка — ретикулоцит — вступает в контакт с эндотелием ближайшего синуса, проходит через его стенку и поступает в общий кровоток. На микропрепарате найти и зарисовать нормобласт. Нормобласт (оксифильный эритробласт)— предшественник эритроцита, цитоплазма заполнена гемоглобином. Небольшое плотное ядро содержит конденсированный хроматин (рис. 3-12). На этой стадии эритроидные клетки выталкивают пикнотичное (дегенерирующее) ядро. Образуется безъядерная клетка — эритроцит.

26

Рис. 3-10. Дифференцировка эритроцита происходит в составе эритробластных островков, стоящих макрофагов, окружённых предшественниками эритроцитов. По мере дифференцировки, а её признаком служит способность синтезировать гемоглобин Hb, пролиферативная активность угасает. Проэритробласты (происходят из CFU-E) не синтезируют Hb и многократно митотически делятся. Базофильный эритробласт активно синтезирует Hb и сохраняет способность к митозу. Полихроматофильный эритробласт содержит значительное количество Hb и также может делиться. Ранние нормобласты, заполненные Hb, по-ви- димому, ещё могут делиться, но постепенно утрачивают способность к делению и выталкивают ядро [из Junqueira L.C., Carneiro J., 1998].

Дифференцировка мегакариоцита

Тромбоциты (кровяные пластинки), участвующие в свёртывании крови и восстановлении целостности стенки сосуда, формируются путём фрагментации цитоплазмы мегакариоцита. Мегакариоцит образуется из мегакариобласта в результате эндомитоза. В ходе многократной репликации ДНК и накопления цитоплазмы без последующего цитокинеза образуется крупная клетка с очень большим дольчатым ядром. Ядро может содержать до 32 копий ядерной ДНК (рис. 3-11).

27

Рис. 3-11. Дифференцировка мегакариоцита. Мегакариобласт путём эндомитоза дифференцируется в мегакариоцит. По мере созревания мегакариоцит увеличивается в размерах, ядро становится дольчатым. Образуется развитая система демаркационных мембран, по которым происходит отделение тромбоцитов [Hees H., Sinowatz F., 1992].

28

Мегакариоцит. На микропрепарате красного костного мозга под малым увеличением хорошо различимы мегакариоциты (рис. 3-12). Мегакариоцит самаякрупная полигональной формы клетка(50–100 мкм), содержит большое полиплоидное дольчатое («лапчатое») ядро. Хроматин распределён диффузно. Характерно наличие псевдоподий. Псевдоподии проникают в просвет капилляров, где от них отделяются тромбоциты (кровяные пластинки).

Рис. 3-12. Мазок красного костного мозга. Преобладают ядерные формы развивающихся клеток крови. Клетки эритроидного ряда группируются вместе, образуя эритробластные островки. Островки разделены кровеносными капиллярами с широким просветом (синусоидами). Нормобласт можно легко идентифицировать под большим увеличением. Размер клетки практически такой же, как у эритроцита, цитоплазма имеет розовый цвет, ядро округлой формы тёмно-синего цвета. Самая крупная клетка на препарате — мегакариоцит, локализующийся на границе с синусоидом. Клетка имеет полигональную форму, большое «лапчатое» ядро, содержащее несколько хорошо выраженных ядрышек.

29

4. Эндомитоз в клетках печени

Печень (рис. 3-13) состоит из долек пяти-шестигранной формы. В центре дольки находится центральная вена, от которой в радиальном направлении идут тяжи эпителиальных клеток (гепатоцитов). Между тяжами гепатоцитов расположены кровеносные капилляры. Часть гепатоцитов, как результат эндомитоза, содержит по два ядра, которые могут содержать как диплоидный, так и полиплоидный набор хромосом (рис. 3-14).

Рис. 3-13. Печёночная долька [из: Junqueira L.C., Carneiro J., 1991].

30

Рис. 3-14. Гепатоциты. Среди гепатоцитов встречаются двуядерные полиплоидные клетки.

II.ВИРТУАЛЬНАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

1.Введение

Генное зондирование позволяет выявить специфические нуклеотидные последовательности ДНК и РНК в исследуемом объекте (биологическая жидкость, биопсия, гистологический срез, мазок). В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации по правилу Уотсона–Крика (A-T и G-C), т.е. к комплементарному спариванию нуклеотидов искомой ДНК (или РНК) с олигонуклеотидным зондом, имеющим специфическую последовательность оснований. В состав зонда во время синтеза олигонуклеотида вводят специальную метку (радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин), позволяющую обнаружить образующиеся двухцепочечные комплексы (рис. 3-15). Гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени с комплементарной ДНК (ДНКзонд) или коплементарной РНК (РНК-зонд) даёт возможность ответить на вопрос, присутствует или нет в ткани ген-мишень, происходит или нет экспрессия этого гена и установить уровень, на котором она может меняться — транскрипция ДНК, сплайсинг РНК, трансляция. В эксперименте и на практике метод гибридизации in situ применяется, например, для:

•визуализации дифференциальной экспрессии генов в эмбриогенезе и дифференцировке стволовых клеток в постнатальном периоде;