Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: « Антигены» – 80 мин

1. Определение понятий: антигены, полные и неполные антигены (гаптены и полугаптены), выполняемые ими функции

2. Классификации антигенов

3. Основные свойства антигенов

4. Химическая природа антигенов и их детерминантные группы. Антигены коньюгированные

5. Строение антигенов

6. Иммунохимическая специфичность антигенов: видовая, групповая, типовая, органоспецифичность, гетерогенные антигены. Аутоантигены

7. Антигены микробной клетки, вирусов. Антигенная мимикрия

8. Реакции иммунитета, направленные на определение антигенов, механизм

9. Реакция агглютинации для определения антигенов бактерий. Механизм, характеристика компонентов, методы постановки

10. Реакция преципитации для определения антигенов бактерий. Механизм, характеристика компонентов, методы постановки

11. Диагностические препараты: иммунные сыворотки, диагностикумы

4. Выполнение практической работы – 30 мин

Практическая работа

1. Изучить строение антигенов по схеме (зарисовать)

2. Изучить строение антигенов бактериальной клетки (зарисовать)

3. Изучить постановку развернутой реакции агглютинации в пробирках по таблице (записать в тетрадь, оформить протокол)

Реакция агглютинации основана на способности бактерий и других клеток склеиваться антителами иммунной сыворотки в присутствии электролита с образованием зерен, комочков, хлопьев. Антиген, участвующий в реакции агглютинации, получил название агглютиногена. Он представляет собой взвесь живых или убитых микробных клеток, эритроцитов, лейкоцитов и других клеток. Антитела называются агглютининами, они содержатся в сыворотке больного или в иммунной диагностической сыворотке, образующийся комплекс антиген+антитело – агглютинат.

Внешнее проявление положительной реакции бывает различным. У безжгутиковых бактерий, имеющих соматический О-антиген, склеивание происходит непосредственно телами бактерий и агглютинат имеет вид мелких компактных зернышек или крупинок. Такая агглютинация называется О-агглютинацией, она бывает тонкозернистой и происходит медленно в течение 18–22 часов. Бактерии, имеющие жгутики, содержат жгутиковый Н-антиген и в присутствии сыворотки они склеиваются жгутиками, образуя крупные хлопья. Такая агглютинация называется Н-агглютинацией, крупнохлопчатой. Она протекает быстрее, в течение 2–4 часов.

Реакция агглютинации применяется в двух направлениях:

1) для определения неизвестной культуры микробов, выделенных от больного или из объектов внешней среды, с помощью известной диагностической сыворотки;

2) для обнаружения и определения титра антител в исследуемой сыворотке с помощью диагностикума.

Для определения неизвестной культуры микробов, выделенных от больного или из объектов внешней среды, с помощью известной диагностической сыворотки. Реакцию агглютинации ставят в сухой чистой нестерильной посуде, без следов кислот, щелочей, дезинфицирующих средств (таблица 5).

Пробирочная или развернутая реакция агглютинации основана на разведении сыворотки и определении ее титра. Из исходной сыворотки готовят основное разведение, которое может быть различным и зависит от предполагаемого титра сыворотки. Для приготовления основного разве­дения 1:50 берут 0,2 мл цельной сыворотки и смешивают с 9,8 мл физиологического раствора. Из этого разведения готовят методом переката кратные двум рабочие разведения, число рядов которого зависит от предполагаемого диагностического титра. Как правило, диагностическую сыворотку разводят до титра, который указан на этикетке. В приготовленные разведения сыворотки добавляют антиген (микроорганизм). Добавлять его можно капельно или объемно. При объемном методе к равному объему разведенной сыворотки добавляют равный объем антигена, при этом разведения сыворотки, соответственно, увеличиваются в два раза. При постановке развернутой реакции агглютинации необходимо, чтобы во всех пробирках был объем, равный 1 мл. Реакция сопровождается двумя контролями: контролем антигена и контролем сыворотки.

После смешивания антигена с антителом штатив с пробирками энергично встряхивают и помещают в термостат на 2–4 часа, а затем до суток выдерживают при комнатной температуре. Через 2–4 часа производят предварительный учет реакции, а через сут­ки окончательный. Сначала учет производят макроскопически, про­сматривая пробирки до встряхивания в проходящем свете (лучше на темном фоне). Учет начинают с контрольных пробирок. При учете об­ращают внимание на выраженность осадка (форму, величину, плот­ность) и степень просветления надосадочной жидкости. Затем про­бирку осторожно встряхивают, постукивая пальцем по донышку, и наблюдают за распределением осадка, величиной зерен осадка и степенью помутнения жидкости. Для более точной оценки результата пробирки просматривают с помощью лупы или в агглютиноскоп.

Оценка и регистрация результатов. При положительной реакции агглютинации образуется рыхлый осадок, который покрывает все дно пробирки в виде раскрытого парашюта или зонтика, обращенного куполом вниз. Осадок легко разбивается и состоит из хлопьев (Н-агглютинация), либо из плотных зерен (О-агглютинация) или из хлопь­ев и зерен (ОН-агглютинация). Жидкость над осадком просветляется в той или иной мере в зависимости от степени агглютинации.

Таблица 5

Схема постановки реакции агглютинации

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения сыворотки Компоненты	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	контроль антигена	контроль сыворотки
1. Физиологический раствор	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
2. Иммунная сыворотка, развед. 1:500, титр 1:8000	1,0	1,0	1,0	1,0	Вдез.р-р 1,0 мл - 1,0
3. Антиген	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.

При отрицательной реакции микробы оседают на дно пробирки по центру, образуя на дне небольшой плотный осадок в виде точки или пятна, надосадочная жидкость остается мутной. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимаясь вверх в виде змейки, при этом жидкость приобретает первоначальную мутность.

Степень положительной реакции агглютинации оценивается в плюсах по четырехбалльной системе:

(++++) – полная агглютинация, очень большой осадок, полное просветление жидкости, при встряхивании осадок разбивается на хлопья или зерна, жидкость остается прозрачной;

(+++) – не полная агглютинация, осадок большой, надосадочная жидкость слегка опалесцирует;

(++) – 50% агглютинация, осадок значительно меньший, надосадочная жидкость слегка мутноватая;

(+) – слабая агглютинация, осадок очень малый, надосадочная жидкость мутная;

(-) – отрицательная реакция, осадок отсутствует или небольшой в виде пятна, при встряхивании легко поднимается в виде змейки, жидкость мутная.

Положительной считается реакция, не менее чем на два плюса.

Контроль сыворотки должен быть прозрачен, без хлопьев и зерен.

Контроль антигена должен быть мутным без хлопьев и зерен. Если наблюдается спонтанная агглютинация, реакция не учитывается.

Результат реакции рассчитайте по данным таблицы 6:

Таблица 6

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения сыворотки	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	Контроль антигена	Контроль сыворотки
Результат	++++	++++	+++	++	-	-

Вывод: Реакция агглютинации ………………………

4. Изучить реакцию латекс-агглютинация (записать в тетрадь, оформить протокол)

Латекс-агглютинация – это реакция, в которой в качестве известного носителя используются частицы латекса. Латекс – водный раствор млечного сока каучуконосных деревьев или синтетических каучуков. Частицы латекса нагружают молекулами антигена или антитела и они приобретают способность склеиваться соответствующими анти­телами или антигенами. Если на латексе адсорбированы растворимые антигены, то эти частицы используются для обнаружения антител в исследуемой сыворотке и наоборот, если на латексе адсорбированы антитела, то частицы используют для обнаружения антигена. Чаще всего, метод используется для определения ревматоидного фактора или HBs-антигена. Ставят реакцию на стекле, смешивая нагруженный антителами латекс и исследуемый антиген, при положительной реакции уже через 5–10 минут образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере.

5. Изучить реакцию коагглютинации (записать в тетрадь, оформить протокол)

В реакции коагглютинации в качестве инертного носителя используется культура золотистого стафилококка (штамм CowanI). Белок А, находящийся на поверхности оболочки этого стафилококка, способен связывать Fc-фрагмент иммуноглобулина G (Ig G1, G2, G4) оставляя свободными активные центры антитела. Эти центры взаимодействуют с соответствующими антигенами, вызывая склеивание стафи­лококков. Реакция применяется для обнаружения и типирования корпускупярных и растворимых антигенов. Для постановки реакции выпус­кают коммерческие стафилококковые реагенты (т.е. стафилококки, нагруженные антителами диагностических иммунных сывороток). К реагенту добавляют 0,01–0,1 мл выделенной культуры, перемешивают покачиванием стекла и через 10–30 минут инкубации при комнатной температуре учитывают как обычную реакцию агглютинации.

6. Изучить реакцию кольцепреципитации (зарисовать, оформить протокол)

Реакция преципитации основана на осаждении коллоидного раствора антигена антителами иммунной сыворотки в присутствии электролита

Антиген, участвующий в реакции преципитации, получил назва­ние преципитиногена. Он представляет собой вещества (белки, липиды, полисахариды, липополисахариды и др.), извлеченные из микроб­ных клеток, тканей животных и человека, исследуемого материала, находящиеся в коллоидном состоянии, в виде прозрачного или слег­ка опалесцирующего раствора. Получают преципитиноген, используя различные методы экстракции веществ из клеток и тканей: растирание с песком или стеклянным порошком с последующей фильтрацией для освобождения от обломков и целых клеток: разрушение путем встряхивания, замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, химическими, биологическими воздействиями, путем электролиза. Реакцию можно поставить разными методами.

Реакцию кольцепреципитации ставят (обнаружение сибиреязвенного антигена в исследуемом материале) в узких пробирках. В опытную пробирку наливают 0,1–0,5 мл диагностической преципитирующей сыворотки, в контрольную – такое же количество нормальной сыворотки. Затем пастеровской пипеткой, держа пробирки наклонно, медленно по стенке в обе пробирки наслаивают преципитиноген, так чтобы слои жидкостей не перемешивались. Пробирки ставят горизонтально и через 1–2 минуты учитывают результат. Если исследуемый антиген соответствует антителам диагностической сыворотки, в опытной пробирке на границе жидкостей образуется белое кольцо преципитации. В контрольной пробирке такого кольца не будет.

В тетради записывают результат и делают вывод:

Реакция преципитации ..................................

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Практическое занятие 4

Тема. Органы иммунной системы. Центральные (костный мозг, тимус) и периферические (лимфатические узлы, селезенка и другие) органы иммунной системы человека. Строение, характеристика. Роль центральных органов в развитии и селекции лимфоцитов. Тимус – центральный орган в развитии Т-лимфоцитов, строение. Роль в иммунитете селезенки, лимфатических узлов, миндалин, пейеровых бляшек и других тканей периферического отдела иммунной системы, их иммуноморфологические особенности. Слизистые ткани и кожа, их место в иммунной системе. Понятие об «иммунной солидарности слизистых». Понятие о звеньях иммунной системы, их взаимосвязь. Т- и В-системы иммунитета. Методы оценки компетентности иммунной системы человека

Цель занятия. Ознакомить студентов с центральными и периферическими органами иммунитета. Ознакомить студентов с методами оценки лабораторных тестов