Практическая работа

1. Изучить схему образования IgE (записать в тетрадь, оформить протокол)

2. Изучить схему строения IgE (зарисовать)

3. Изучить механизм развития первого типа гиперчувствительности по схеме (зарисовать)

4. Изучить механизм развития второго типа иммупатологической реакции по схеме (зарисовать)

5. Изучить метод определения общего иммуноглобулина Е в сыворотках крови (записать в тетрадь, оформить протокол)

Количественное определение уровня общего IgE (МЕ/мл) в сыворотке, плазме крови или других биологических жидко­стях человека важно при исследовании гуморального имму­нитета, диагностике иммунодефицитов, паразитарных забо­леваний, парапротеинемий, и, особенно, при аллергических заболеваниях.

Клетки «вооруженные» IgE-антителом – тучные клет­ки тканей и базофилы крови, реагируют на «свой» антиген сильнее и быстрее, чем макрофаги и гранулоциты, несущие аналогичные IgE-антитела.

Система IgE имеет особую регуляцию, мало связан­ную с регуляцией синтеза остальных иммуноглобулинов. Это позволяет использовать определение общего IgE для диффе­ренциального диагноза, прогноза и контроля терапии в тех случаях, когда определение других иммуноглобулинов мало или неинформативно.

Известны несколько методов определения общего IgE: конкурентный радиоиммунный, иммунорадиометрический с последовательным связыванием двух антител (сэн­двич-тест), сэндвич-тесты на основе моно- и поликлональных антител к IgE, упрощенная модификация иммуноферментного анализа (ИФА): латекс-тест, иммунохроматография. Наибольшее распространение полу­чил метод ИФА.

Иммуноферментный анализ

Техника постановки:

- в соответствующие лунки планшета внести в дублях ка­либраторы, контрольную сыворотку и исследуемые про­бы по 20 мкл. В лунки А1 и В1 внести калибратор «О» – эти лунки являются бланком;

- внести сразу во все лунки по 100 мкл конъюгата;

- перемешать на шейкере в течение 20–30 с, закрыть план­шет пленкой и инкубировать в термостате при 37 °С 1,5 ч;

- после инкубации промыть планшет четыре раза промы­вающим ра-створом по 200 мкл. Стряхнуть остатки рас­твора на фильтровальную бумагу;

- внести во все лунки по 150 мкл проявляющего раствора и инкуби-ровать в термостате при 37°С 15 мин.;

- внести в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента;

- измерить на мультискане при 450 нм оптическую плот­ность вне-сенных проб.

6. Изучить метод определения специфического иммуноглобулина Е в сыворотке крови (записать в тетрадь, оформить протокол)

При аллергопатологии тучные клетки, базофилы, несущие рецепторы IgE, при повторной встрече с антигеном (ал­лергеном) образуют на своей поверхности иммунный комплекс «АГ + IgE». В результате происходит актива­ция тучных клеток с выбросом огромного количества биологически активных веществ (медиаторов) с дегрануляцией тучных клеток, оказывающих повреждающее дей­ствие на клетку. Измерение общего IgE в сыворотке крови не может слу­жить единственным и главным показателем в дифферен­циальной диагностике аллергических и неаллергических заболеваний со сходной симптоматикой и локализацией. Только обнаружение диагностически значимых концен­траций специфических IgE антител указывает на возмож­ное участие аллергии немедленного типа в патогенезе за­болевания. Существуют различные тест-систсмы (ИФА, радиоим­мунный, иммунохемилюминесцентный) для определе­ния специфических IgE к аллергенам. Остановимся на одном из них – «Иммунодоте ИФА».

Иммунодот ИФА

Принцип метода – твердефазный двустадийный ИФА. Пять аллергенов (пищевые, пыльцевые, бытовые или грибковые), а также контроли (положительный, отрицатель­ный) нанесены в виде точек на полистироловую поверхность индикаторной полоски. При первой инкубации IgE антитела сыворотки связываются с соответствующими аллергенами. Не связавшиеся компоненты отмываются. При второй инку­бации к связавшимся молекулам IgE присоединяются анти-IgE-мышиные моноклональные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Связавшийся фермент после промывки вы­являют с помощью цветной реакции с хромогеном. Интен­сивность окраски аллергена прямо пропорциональна содер­жанию специфических IgE-антител к данному аллергену.

Оценка визуальная в соответствии с классами RAST (от 0-го до 4-го класса) по карточке интерпретации окраски.

Техника постановки анализа:

- соответствующие индикаторные полоски с пищевыми, пыльцевыми, эпидермальными, бытовыми или грибко­выми аллергенами вставить в инкубационную камеру, промаркировать;

1-я инкубация:

- внести 1,0 мл неразведенной анализируемой сыворотки в отделе-ние камеры с соответствующей полоской. Накрыть инкубационную камеру и инкубировать 2 ч при комнат­ной температуре при постоян-ном встряхивании на шейкере;

- если объем анализируемого образца меньше 1,0 мл, пробу можно развести физиологическим или промывочным рас­творами не более чем в 5 раз и инкубировать в течение ночи;

- после инкубации слить содержимое лунок, внести в ка­меры по 1,5 мл промывочного раствора и инкубировать 5 мин. при комнатной температуре при постоянном встряхивгнии. Процедуру промывки повторить еще 2 раза;

2-я инкубация:

- внести 1,0 мл раствора конъюгата в отделения камеры;

- закрыть инкубационную камеру и инкубировать 1 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании на шейкере;

- после инкубации провести промывку 3 раза;

проявление:

- внести по 1,0 мл проявляющего раствора в отделения ка­меры и инкубировать не менее 15 мин. при комнатной температуре при постоянном встряхивании;

- после инкубации содержимое лунок слить и внести в ка­меры по 1,5 мл дистиллированной воды.

Учет результатов:

- вынуть полоски из камеры, промокнуть фильтровальной бумагой и просушить не менее 30 мин.;

- оценка результатов визуальная, путем сравнения резуль­татов интенсивности окраски с цветовой шкалой на кар­точке интерпре-тации окраски. Приблизительное соответ­ствие класса RAST содер-жанию специфических IgE анти­тел следующее (табл.17):

Таблица 17

Класс RAST	IgE антитела МЕ/мл	Интерпретация
0	<0,35	Отсутствие или присутствие очень низкого количества специфических IgE-антител
1	0,35-0,70	Присутствие низкого количества специфи­ческих IgE-антител
2	0,71-3,50	Присутствие среднего количества специ­фических IgE-антител
3	3,51-17,5	Присутствие значительного количества специфических IgE-антител
4	>17,5	Присутствие очень большого количества специфических IgE-антител

Тест-система позволяет определить сенсибилизацию к пищевым, пыльцевым, бытовым, эпидермальным или гриб­ковым антигенам-аллергенам.

5. Подведение итогов занятия - 5 мин

Практическое занятие 13

Тема. Иммунопатология. III тип – иммунокомплексный. Иммунологи-ческая толерантность. Центральная и периферическая толерант-ность. Индукция толерантности в неонатальном и взрослом периодах жизни. Адоптивный период в индукции толерантности. Особенности индукции толерантности, значение дозы антигена. Механизмы формирования толерантности к «своему». Понятие об анергии, делеции, супрессии, игнорировании. Роль Т- и В-лимфоцитов, генетических факторов в развитии толерантности. Аутоиммунные состоя­ния. Количественное определение антител к тиреоглобулину. Определение ревматоидного фактора. Латекс-тест

Цель занятия. Ознакомить с III типом иммунопатологической реакции. Ознакомить с понятием толерантность, механизмами развития. Дать представление о диагностике аутоиммунных состояний