Хронологическая карта занятия:
1.Организационная часть.
2.Тестовый контроль базового уровня знаний.
3.Объяснение практического задания.
4.Самостоятельная работа.
5.Проверка выполненных работ в альбомах.
6.Контроль конечного уровня знаний.
7.Установка задания для подготовки к следующей теме.
Теоретический обзор
Микроскопия живых систем в биологии
Биология — дословно в переводе с греч. — учение о жизни. Термин «биология» ввёл в обращение Жан Батист Ламарк в 1802 г. Он сделал это одновременно и независимо от немецкого учёного Готфрида Рейнхольда Тревирануса. В настоящем понимании биология — наука о живом. Живые системы в результате миллиардов лет эволюции произошли из неживого и обладают качественно новым свойством «жизнь». Биология изучает закономерности развития, строения и жизнедеятельности всех живых систем (организмов) от вирусов до высших растений и животных. Важнейшим методом биологии является изучение объектов в проходящим свете с применением оптических приборов, таких, как светооптический микроскоп. Этот старейший инструмент произвёл революцию в биологии, дав возможность открыть клеточное строение живых организмов. Одним из претендентов на звание изобретателя микроскопа считается итальянский физик Галилео Галилей, сконструировавший в 1609 г. зрительную трубу с двояковыпуклой и двояковогнутой линзами и нацеливший её в небо. Изучая небесные тела, Галилей решил изменить положение линз в зрительной трубе таким образом, чтобы с её помощью можно было рассматривать предметы, расположенные прямо перед зрительной трубой. В 1624 г. он усовершенствовал увеличительный прибор, которому друг Галилея Джованни Фабер в 1625 г. дал название «микроскоп» по аналогии с телескопом. В 1665 г. английский естествоиспытатель Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп, при помощи которого стал изучать растения, в частности, кору пробкового дерева. В результате этого исследования появился термин «клетка». Голландский натуралист Антони ван Левенгук — первый, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов. Он открыл мир одноклеточных организмов, о чём в 1673 г. доложил Лондонскому королевскому обществу.
Устройство прямого светового микроскопа
Микроскоп состоит из оптической, осветительной и механической систем (рис. 1-1).
•Механическая система служит для управления оптической и осветительной системами. К ней относятся основание, тубусодержатель, предметный столик, тубус (зрительная труба), револьвер, макрометрический винт, микрометрический винт, коробка с механизмом микрометрической фокусировки, кронштейн конденсора, головка тубусодержателя.
Штативная подставка выполняется в виде тяжёлой отливки, обычно имеет подковообразную форму. К подставке на шарнире прикреплён тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа. На тубусодержателе укреплён предметный столик, на который помещается изучаемый препарат. На столике имеются клеммы-зажимы для закрепления препарата. С тубусодержателем подвижно связан тубус, в его верхний конец вставляется окуляр. В верхней части тубусодержателя укреплена головка, с которой соединён револьвер — круглая вращающаяся пластинка. В ней имеются 4 отверстия с резьбой для ввинчивания объективов. Револьвер имеет защёлкивающий механизм, который обеспечивает фиксацию центрированного положения объектива. Вращая револьвер, можно установить под тубус нужный объектив. Для наведения на резкость тубус необходимо поднимать или опускать. Для этого
4
существуют макрометрический (для грубой первоначальной фокусировки) и микрометрический (для тонкой фокусировки) винты.
•Оптическая система даёт увеличенное перевёрнутое изображение исследуемого материала. К ней относятся окуляр и объективы. Они состоят из системы линз, заключённых в металлическую оправу. Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Увеличение окуляра определяется цифрой, указанной на оправе (7х, 10х, 15х). Объективы ввинчиваются в револьвер. Увеличение объектива обозначено цифрой на боковой части оправы объектива (4х, 10х, 40х, 90х, 100х). Объективы 4х, 8х, 40х — это сухие объективы, т.к. между фронтальной линзой объектива и препаратом находится воздух. Объективы с водной (увеличение 40х, 60х) и масляной (увеличение 90х, 100х) иммерсией относятся к погружным. При работе с ними на препарат наносится капля воды или иммерсионного масла, при этом фронтальная линза объектива погружается в эту каплю. Объектив с водной иммерсией на оправе имеет белую полоску, объектив с масляной иммерсией — чёрную полоску (табл. 1-1). Инвертированные микроскопы отличаются от прямых тем, что объектив в них располагается под предметным столиком, на котором находится объект исследования. Применяется для исследования культуры микроорганизмов, клеток, тканей, или органов.
•Осветительная система предназначена для направления световых лучей на рассматриваемый объект. Она состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой, откидной линзой и съёмным светофильтром. Зеркало подвижно укреплено в нижней части тубусодержателя и может вращаться, что позволяет осветить объект, пользуясь различными источниками света. Зеркало имеет две отражающие поверхности: вогнутую и плоскую. Первая используется при слабом и рассеянном освещении, её рекомендуется употреблять при работе без конденсора и с малым увеличением. Плоская поверхность зеркала применяется при сильном и равномерном освещении. Ею пользуются при работе с конденсором и большим увеличением.
Конденсор служит для собирания лучей света в сходящийся пучок. Система вмонтированных линз позволяет добиться различной степени концентрации световых лучей.
При работе с объективами малого увеличения рекомендуется опустить конденсор при помощи рукояток вниз и использовать откидную линзу. При работе с объективами 40х и 90х конденсор должен быть поднят до упора и откидная линза конденсора выведена из хода лучей.
Непосредственно под линзой конденсора расположена ирисовая диафрагма. Она служит для регулирования величины проходящего пучка лучей. Диафрагма состоит из подвижных металлических пластинок, веерообразно налегающих друг на друга. Движением рычага можно сдвигать и раздвигать пластинки, изменяя диаметр отверстия между ними и тем самым регулируя освещенность поля зрения микроскопа. В нижней части конденсора расположены откидная линза и рамка для светофильтра.
5
Рис. 1-1. Прямой световой микроскоп. Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель [83].
Таблица 1-1. Характеристика объективов
Маркировка |
Иммерсия |
Увеличение |
Числовая |
Разрешающая |
|
объектива |
апертура |
способность, мкм |
|||
|
|
||||
8×0,20 |
Нет |
8 |
0,20 |
1,80 |
|
20×0,40 |
Нет |
20 |
0,40 |
0,90 |
|
40×0,65 |
Нет |
40 |
0,65 |
0,55 |
|
40×0,75 |
Водная |
40 |
0,75 |
0,48 |
|
90×1,25 |
Масляная |
90 |
1,25 |
0,29 |
•Увеличение микроскопа — физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа приблизительно оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра.
6
•Разрешающая сила, определяющая возможность прибора давать отдельное изображение каждой из двух близлежащих точек изучаемого объекта, зависит от предела разрешения, то есть минимального расстояния между двумя точками, при котором еще можно различить каждую из них. Предел разрешения вычисляется с помощью формулы:
d = nSin0,61λα ,
где: d — минимальный размер наблюдаемого объекта, α — половина угловой ширины конуса световых лучей, собираемых линзами объектива; n — коэффициент преломления среды, отделяющей изучаемый объект от линз объектива или конденсора; λ — длина волны света. nSinα — апертура.
Подчёркиваем, что разрешающая сила связана обратной зависимостью с пределом разрешения, то есть она тем больше, чем меньше этот предел. Повысить разрешение микроскопа можно за счёт увеличения апертуры. Увеличить апертуру можно путём увеличения коэффициента преломления. Коэффициент преломления жидких сред (иммерсионные среды) больше коэффициента преломления воздуха (n = 1,0). В микроскопии используют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную. Так как
Sinα < 1, а показатель преломления большинства материалов, применяющихся в оптических приборах, не превышает 1,6, максимальная численная апертура линз при масляной иммерсии равна 1,4. Масло улучшает видимость объекта, т.к. оно имеет близкий к стеклу показатель преломления света и большая часть лучей, проходящих через препарат, попадает в объектив. Исходя из этого и на основании вышеприведённой формулы, можно вычислить максимально возможное разрешение при использовании световой волны видимого света. Теоретически возможный предел разрешения для обычных светооптических микроскопов, работающих в проходящем свете, составляет примерно 0,25 мкм.
•Оптические артефакты. Объектив состоит из нескольких стеклянных линз. Первая линза— сферическая или полусферическая — предназначена для получения увеличенного изображения. Все остальные линзы корригируют оптические артефакты (аберрации).
Хроматические аберрации. Фокусное расстояние линзы для лучей разной длины волны различно. Поэтому при использовании немонохроматического света формируемое линзой изображение предмета имеет окрашенные края. Хроматические аберрации устраняют ахроматические и апохроматические объективы.
Сферические аберрации. Различие оптических свойств центральной и периферической частей сферической линзы — причина сферических аберраций. Их устраняют апохроматические объективы. Сферическая линза не позволяет одновременно фокусировать изображение по всему полю. Для устранения этого недостатка применяют специальные объективы — планахроматы и планапохроматы. Наилучшим объективом считают планапохромат с высокой числовой апертурой.
Устройство стереоскопического микроскопа
Стереоскопический микроскоп даёт прямое объёмное (трёхмерное) изображение и позволяет, благодаря своим оптико-техническим характеристикам, выполнять препаровальные работы в эксперименте, а также проводить хирургические манипуляции в клинике (табл. 1-2).
Оптическая часть микроскопа включает окуляр с различной степенью увеличения (6х, 8х, 12х, 5х) и объектив со сменными линзами (увеличение 0,6х, 1х, 2х, 4х, 7х).
Осветительная часть состоит из поворотного отражателя, имеющего с одной стороны плоское, с другой — матовое стекло. Иногда к микроскопу придается трансформатор и осветитель с коллектором.
К механической системе относят штатив, предметный столик, 2 окулярные трубки, кремальеры (винты для регулировки резкости), рукоятку переключения со шкалой, на которой нанесены цифры увеличения объектива.
7