Meditsinskaya_genetika_3

родителей составит 25%. Скрининг популяции на гетерозиготное носительство включает гены:

1.бета-талассемии;

2.серповидноклеточной анемии;

3.болезни Тея-Сакса;

4.муковисцидоза.

Благодаря скринингу муковисцидоз был практически искоренен у еврейского населения США.

Популяционно-статистический метод

Популяционно-статистический метод лежит в основе популяционной генетики, изучающей генетическую структуру популяций, закономерности распределения аллелей и изменение частот генов при смене поколений. В медицинской генетике популяционностатистический метод используется при изучении наследственных болезней и болезней с наследственной предрасположенностью. В частности, он позволяет определить следующее:

•заболеваемость населения различными наследственными болезнями;

•закономерности, которым подчиняется распространение наследственных заболеваний, и причины их распространения;

•встречаемость патологических генов и генотипов в популяциях людей различных местностей, стран и городов;

•прогнозирование распространенности наследственных заболеваний в последующих поколениях.

Генетический анализ популяции начинается с изучения распространенности того или иного признака (или наследственной болезни), который интересует исследователя. Зная частоту признака, определяют генофонд и генетическую структуру популяции по этому признаку. Генофонд популяции характеризуется частотой аллелей изучаемого гена, а структура популяции — частотой генотипов, контролирующих развитие альтернативных значений изучаемого признака. Частота того или иного генотипа и популяции — это относительное число особей, обладающих данным генотипом. Существует несколько способов её выражения. Например, если в популяции на каждые 250 человек приходится 3 человека с интересующим нас генотипом, то частота этого генотипа в популяции может быть выражена следующим образом:

•В процентах от общего числа особей популяции, которое принимается за 100%, — 1,2%.

•В долях единицы, за которую принимают общее число особей, — 0,012.

•В виде пропорции, где указывается число особей с интересующим нас генотипом относительно того количества людей, среди которых такие особи встречаются, — 3 : 250.

В1908 году английский математик Г. Харди и немецкий врач В. Вайнберг независимо друг от друга открыли основную закономерность, позволяющую исследовать генетическую структуру популяций.

Закон Харди-Вайнберга гласит: в больших популяциях при условии свободного скрещивания и при отсутствии притока мутаций и отбора устанавливается равновесие частот генотипов, которое сохраняется из поколения в поколение.

Закон Харди-Вайнберга устанавливает математическую зависимость между частотами аутосомных генов и генотипов и выражается следующими формулами:

P(А) + q(а) = 1

р2(АА) + 2pq (Аа) + q2(аа) = 1,

где р (А) — частота доминантного аллeля гена,

q(a) — частота рецессивного аллeля гена,

p2(АА) — частота особей, гомозиготных по доминантному аллeлю,

2pq (Аа) — частота гетерозиготных особей,

q2 (аа) — частота особей, гомозиготных по рецессивному аллелю, то есть частота особей с рецессивным признаком,

р2(АА) + 2pq (Аа) — частота особей с доминантным признаком,

2pq (Аа) + q2 (аа) — частота особей, в генотипе которых имеется рецессивный ген.

Закон Харди-Вaйнберга используется не только для аутосомных генов, но и для генов, сцепленных с половыми хромосомами. Для генов, расположенных только в Х-хромосомe, формулы закона приобретают следующий вид:

p(ХA) + q(Хa)=1

0,5 • p2 (ХAХA) + pq (ХАХa) + 0,5 * q2 (Хa Х*) + 0,5 • р (XAY) + 0,5 • q (XaY) = 1

Положения закона Харди-Вайнбeрга применимы и к множественным аллелям. Так, если аутосомный ген «А» представлен тремя аллелями (А, а1, а2), то формулы закона приобретают следующий вид:

p(A) + q(a1) + r(a2) = l

p2 (АА) + q2(a1 а1) + r2(a2a2) + 2pq (Аа1) + 2рr (Аa2) + 2qr (а1 а2) = 1

Теоретически закон Харди-Вайнбeрга справедлив только для равновесных популяций. Равновесными называются такие популяции, в которых выполняются следующие условия:

Численность популяции является достаточно большой.

Имеет место панмиксия, то есть случайный подбор супружеских пар, без тенденции вступления в брак с партнерами, подобными или противоположными по генотипу.

Гетерозиготные и гомозиготные особи имеют равную плодовитость.

Отсутствует приток аллелей, вызываемый мутационным процессом или миграцией.

Отсутствует отток аллелей, вызываемый отбором.

Поколения не перекрываются во времени.

Несмотря на то, что ни в одной конкретной популяции эти условия не соблюдаются, в большинстве случаев расчеты по формулам закона Харди-Вайнбeрга настолько близки к действительности, что этот закон оказывается вполне пригодным для анализа генетической структуры популяций.

С помощью формулы Харди-Вайнбeрга можно рассчитывать частоты мутантных генов в популяциях.

Практические навыки

1. Виртуальная лаборатория. ПЦР в классическом формате

Введение

Разработка принципов ПЦР стала поистине революционизирующим этапом в развитии молекулярной генетики, что нашло свое отражение в присуждении ее автору К. Муллису в 1993 году Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Это метод находится в постоянном развитии, с появлением все новых и новых модификаций, существенно расширяющих его диагностические и исследовательские возможности.

ПЦР проводится в амплификаторе, который выполняет циклы попеременного нагрева и охлаждения. В состав реакционного раствора с определенной концентрацией ионов магния и рН входит ДНК-матрица, четыре вида дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, а также термостабильная ДНК-полимераза, сохраняющая свою активность при нагревании раствора до высоких температур. Реакция инициируется добавляемыми в раствор праймерами – олигонуклеотидными последовательностями, фланкирующими «зону интереса» и играющими роль затравок в процессе комплементарного синтеза ДНК. Обычно ПЦР осуществляется в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах (амплификаторах), контролирующих заданные параметры реакции (температура, длительность отдельных этапов, число циклов и т.д.). Современные амплификаторы способны проводить одновременную амплификацию многих десятков и даже сотен образцов ДНК, в том числе (в отдельных блоках прибора) – одновременно по нескольким самостоятельным протоколам.

Дальнейший анализ продуктов ПЦР в процессе прямой ДНК-диагностики предполагает исследование конкретных особенностей амплифицированного участка гена. Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты

амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие – по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т.е. ДНКдиагностика болезни (рис. 2). Таким же сравнительно простым путем с помощью анализа размеров продуктов ПЦР на электрофореграмме может проводиться прямая детекция относительно коротких делеций и вставок в составе амплифицированного участка гена. Например, в большинстве случаев аутосомно-доминантной дофа-независимой дистонии у больных имеет место одна и та же типичная гетерозиготная делеция трех нуклеотидов GAG в 5-м экзоне гена DYT1; таким образом, непосредственное выявление при электрофорезе аномально короткого ПЦР-продукта, отличающегося от нормального фрагмента на 3 п.о., может служить молекулярным подтверждением данного диагноза.

В том случае, если исследуемый участок ДНК целиком входит в состав протяженной делеции, ПЦР-амлификация ДНК с данного делетированного аллеля осуществляться не будет в связи с отсутствием мест для гибридизации праймеров. При этом гомозиготная делеция будет диагностирована на основании полного отсутствия ПЦР-продукта реакции (синтез ДНК невозможен с обеих копий гена). В случае же гетерозиготной делеции возможно выявление ПЦР-продукта, синтезированного с нормального (сохранного) аллеля, однако для достоверной диагностики такой мутации необходимо использование более сложных методов визуализации ДНК, позволяющих оценивать дозу конечного ПЦР-продукта.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2.Прямая ДНК-диагностика спиноцеребеллярной атаксии-1 (электрофорез ДНК в агарозном геле). Дорожка 1 – маркер, дорожки 2, 3, 5, 7 – больные, дорожки 4 и 8 – носители мутантного гена на пресимптоматической стадии, дорожка 6 –здоровый индивид. Длинной стрелкой указан мутантный аллель (экспансия CAG-повторов гена SCA1), короткой стрелкой – нормальный аллель.

Протокол ПЦР

1.Забор и подготовка материала для исследования, направлен на максимальное сохранение целостности геномной ДНК. На практике в качестве источника образца можно использовать клеточный (кровь) или тканевой материал, различные жидкости организма

(слюна, моча, спинномозговая жидкость и т.д.) Отобранный материал хранится до анализа в холодильниках при температуре от -20 до -80оС, при этом стоит избегать повторных циклов оттаивания-замораживания для исключения возможности разрушения молекул ДНК.

2.Выделение геномной ДНК, заключается в разрушение клеточной стенки, ядра, инактивации ДНКаз (ферменты разрушающие молекулу ДНК). Разрушение молекул РНК, если матрицей в ПЦР выступает ДНК (РНКаза А), очистка от белковых (протеиназа К) и

липидных (липаза) компонентов клетки. В настоящее время этап выделения ДНК стандартизирован путем использования наборов (китов) предлагаемых широким спектром производителей.

3.Постановка реакции, осуществляется на льду или в специализированных контейнерах. Перед началом работы размораживают все компоненты реакции, кроме ДНК-полимеразы, и помещают их на лед для временного хранения.

В предварительно охлажденные пробирки эппендорф добавляются компоненты реакции: Буфер (смесь катионов и анионов определенной концентрации), 2'-дезоксинуклеозид-5'- трифосфаты (дУTФ, дATФ, дГTФ, дЦTФ и дTTФ, являются строительным материалом при построении цепи ДНК), ДНК-полимераза (термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus, осуществляет матричный синтез нуклеиновых кислот в

направлении 5′→3′). Прямой и обратный праймеры (короткие синтезированные олигонуклеотиды, строго комплементарные ДНК-мишени). Ионы Mg2+, в составе солей MgCl2 (необходимы для ферментативной активности Taq-полимеразы). ДНК-мишень (анализируемый образец геномной ДНК, полученный на этапе выделения). Реакционную смесь перемешивают в 0,2 мл пробирке на мешалке-вортексе и осаждают на микроцентрифуге 15 секунд при максимальных оборотах (13,3 тыс. об/мин).

4.Амплификация фрагмента ДНК, осуществляется с использованием специальных машин ПЦР-термоциклеров. В ходе реакции происходит многократное повторение этапов: денатурации, отжига и элонгации.

Установите программу термоциклера (табл. 1) и поместите пробирку с реакционной смесью в лунку термоциклера MJ Mini Personal Thermal Cycler, плотно закройте крышку термоциклера.

Таблица 1. Режим ПЦР-амплификации фрагмента гена

5. Визуализация и интерпретация результатов. После окончания ПЦР-амплификации,

образцы разделяют методом гель электрофореза в агарозном геле в присутствии интеркалирующиго агента – бромистый этидий. После окончания электрофореза гель анализируют в УФ-свете на трансиллюминаторе.

ПЦР анализ чувствительности к варфарину

Метаболизм лекарств находится под генетическим контролем. Генотипирование по генам метаболизма ксенобиотиков необходимо для выявления индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам. Особенности генотипа пациента, влияющие на действие лекарственного препарата, изучает фармакогенетика. Сутью исследования в фармакогенетике являются полиморфные участки генов, вовлечённые в фамакокинетику лекарства, поэтому фармакогенетика относится к инструментам персонализировнной медицины.

Фармакогенетические тесты позволяют:

•прогнозировать эффективность конкретного препарата у пациента

•подобрать наиболее эффективное лекарственное средство

•назначить индивидуальную дозировку препарата

Варфарин — антикоагулянт непрямого действия — подавляет витамин K-зависимый синтез биологически активных форм кальций-зависимых факторов свёртывания крови II, VII, IX и X. Риск развития чрезмерной гипокоагуляции, обусловленной передозировкой варфарина, при подборе индивидуальной дозы. Подбор варфарина на основании генотипирования позволяет повысить безопасность терапии.

Индивидуальная чувствительность к варфарину обусловлена в первую очередь полиморфизмом гена CYP2C9, кодирующего один из ферментов семейства цитохрома P450, метаболизирующего варфарин. Активность этого фермента детерминирована генетически носительством *1, *2 или *3 аллеля в его гене CYP2C9. Аллель *1 обеспечивает полный метаболизм препарата, аллели *2 или *3 не обеспечивают эффективный метаболизм (биотрансформация варфарина замедленна). Пациенты с полиморфизмом гена CYP2C9, включая аллели CYP2C9*2 и CYP2C9*3, могут иметь повышенную чувствительность к варфарину и повышенный риск развития кровотечений (табл. 2). В российской популяции не менее 18% людей являются носителями «медленных» аллелей гена CYP2C9.

Таблица 2. Терапевтическая доза варфарина в зависимости от генотипа по гену

CYP2C9

Материалом для анализа чувствительности к варфарину является геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови пациента. ПЦР выполняется с двумя парами аллель-специфических праймеров к аллелю СYP2C9*2 (Arg144Cys) и к аллелю СYP2C9*3 (Ile359Leu) с помощью тест-систем «SNP-экспресс» производства НПО «Литех» (г. Москва). Продукт ПЦР визуализирован с помощью гель-электрофореза в присутствии этидиум бромида (рис. 3).

В качестве образца решим типовую задачу по популяционной генетике.

Кистозный фиброз у человека наследуется по аутосомно-рецессивному типу (а). Частота рождения больных детей аа составляет примерно 1: 1600. Таким образом, частота больных людей в популяции составляет q2 (аа) = 1/1600 = 0,0006, следовательно, частота рецессивного гена q (а) = 0,025 и частота доминантного гена p (А) = 0,975. Вероятность гетерозиготного носительства гена кистозного фиброза в популяции составляет 2pq (2Аа) = 2∙ 0,975 ∙ 0,025 = 0,05. В неблизкородственных браках вероятность рождения больного ребенка аа равна 2pq ∙ 2pq ∙ ¼ = 0,05 ∙ 0,05 ∙ 0,25 = 0,000625 ≈ 1: 1600. В случае близкородственных браков, частота рождения рецессивных гомозигот будет значительно выше, чем в популяции. На точность расчетов может повлиять то, что не все рецессивные гомозиготы могут достигать половой зрелости и участвовать в размножении.

Задача 1. Аниридия характеризуется отсутствием радужной оболочки и наследуется как доминантный аутосомный признак. Она встречается с частотой 1 : 10000 (В.П. Эфроимсон, 1968). Какова частота доминантного аллeля в популяции?

Решение:

Аниридия — это доминантный аутосомный признак. Альтернативный ему признак

— отсутствие аниридии, или нормальное строение радужной оболочки. Изучаемый ген представлен двумя аллелями. Возьмем для обозначения изучаемого гена букву «А». Таблица «признак — ген» будет иметь следующий вид:

Формулы закона Харди-Вайнберга, используемые для решения задачи, имеют следующий вид:

p(A) + q(a) = 1

р2(АА) + 2pq (Аа) + q2 (аа) = 1

Дано: p2(АА) + 2pq (Аа) — частота доминантного признака Необходимо найти: р (А) — частота доминантного аллeля. Из условия задачи нам известно, что

р2 + 2pq = 1: 10000 = 0,0001

Известно, что р2 + 2pq + q2 = 1, поэтому q2 = 1 - (р2 + 2pq ) = 1 - 0,0001 = 0,9999 q = V q2=V 0,9999 = 0,9999499

Известно, что р + q = 1, поэтому

p=1 – q = 1 -0,9999499 = 0,0000501 (0,00501%)

Ответ: Частота доминантного аллeля в популяции равна 0,0000501 (0,00501%)

Задача 2. Альбинизм общий наследуется как аутосомный рецессивный признак. Заболевание встречается с частотой 1 : 20 000. Вычислите количество гетерозигот в популяции.

Согласно условию задачи, нам известно, что частота индивидуумов с данным заболеванием равна:

q2 (аа) = 1: 20 000 = 0,0001

необходимо найти частоту гетерозигот в популяции: 2pq,

мы можем вычислить частоту рецессивного аллеля: q (а) = 0,01 используя уравнение p + q = 1, вычисляем частоту доминантного аллеля: p (А) = 1 – 0,01 = 0,09

используя уравнение р2(АА) + 2pq (Аа) + q2 (аа) = 1, высчитываем частоту гетерозигот в популяции

2pq (Аа) = 2 ∙ 0,09 ∙ 0,01 = 0,0018 = 0,18%

Ответ: частота гетерозигот в популяции равна 0,0018 или 0,18%.

Задача 3. Галактоземия — аутосомно-рецсссивное заболевание. Частота патологического гена в США равна приблизительно 0,3%. Какова частота людей, не страдающих этим заболеванием?

1 способ:

Согласно условию задачи, нам известно, что частота рецессивного аллеля равна: q (а)= 0,3% = 0,003

используя уравнение p + q = 1, вычисляем частоту доминантного аллеля p (А): p (А) = 1 – 0,003 = 0,997

используя уравнение р2(АА) + 2pq (Аа) + q2 (аа) = 1, высчитываем частоту индивидуумов с доминантным признаком в популяции:

р2(АА) + 2pq (Аа)= 0,9972 + 2 ∙ 0,997 ∙ 0,003 = 0,994009 + 0,005982 = 099991

2 способ:

Согласно условию задачи, нам известно, что частота рецессивного аллеля равна: q (а)= 0,3% = 0,003

следовательно, частота людей, страдающих генотипом в популяции равна: q2 = 0,0032 = 0,000009

используя уравнение р2(АА) + 2pq (Аа) + q2 (аа) = 1, высчитываем частоту индивидуумов с доминантным признаком в популяции:

р2(АА) + 2pq (Аа)= 1 - q2 = 1 – 0,000009 = 0,999991

Ответ: частота людей, не страдающих заболеванием, равна 0,999991 или примерно 99,99%

Задача 4. Пентозурия эссенциальная, характеризующаяся выделением с мочой пентозоксидулозы, наследуется как аутосомно-рецессивный признак и встречается с частотой 1:50 000 /Л.О. Евдалян, 1917 г./. Определите частоту доминантного и рецессивного аллеля в популяции.

Ответ: p = 0,99553, q = 0,00447

Задача 5. Одна из форм глюкозурии наследуется как аутосомно-рецессивный признак и встречается с частотой 7 : 1000000. Определить частоту встречаемости гетерозигот в популяции.

Ответ: частотагетерозигот в популяции равна 0, 0052775.

Задача 6. Гиперхолестеринемия (повышенное содержание в крови холестерина) является аутосомно-доминантным' признаком. Среди населения Европы Гиперхолестеринемия встречается с частотой 2:1000 новорожденных. Определите частоту доминантных и рецессивных генов по данному признаку.

Ответ: p = 0,95528, q = 0,04472

Задача 7. Врожденный вывих бедра наследуется как аутосомно-доминантный признак со средней пенетрантностью 25%. Заболевание встречается с частотой 6:10000 /В.П.Эфронмсон, 1968 г./. Определите число гомозиготных особей по рецессивномугену.

Согласно условию задачи, нам известно, что частота индивидуумов с данным заболеванием равна:

Однако приведенное в задаче число больных представляет собой не р2(АА) + 2pq (Аа), а только 25% от числа носителей гена А,

Следовательно число носителей гена А без учета пенетрантности в 4 раза больше: P2(АА) + 2рq (Аа) = 24: 10 000 =

необходимо найти частоту рецессивных гомозигот в популяции: q2,

Из формулы р2(АА) + 2pq (Аа) + q2 (аа) = 1 ясно, что число гомозиготных по

рецессивному гену особей (аа) q2= 1 –( р2(АА) + 2pq (Аа)). q2 = 1 - 0,0024 = 0,9976

Ответ: частота рецессивных гомозигот в популяции равна 0,9976 или 99,76%.

Задача 8. Подагра встречается у 2% людей и обусловлена аутосомным доминантным геном. У женщин ген подагры не проявляется, у мужчин пенетрантность его равна 20% (В.П. Эфроимсон, 1968). Определите генетическую структуру популяции по анализируемому признаку, исходя из этих данных.

Ответ: p2 + 2pq = 0,2; p = 0,106; q = 0,894

Задача 9. Ретинобластома наследуется по аутосомно-доминантному типу с пенетрантностью 60%. В Европе больные ретинобластомой встречаются с частотой 0,03. Какова в популяции частота гена, определяющего развитие ретинобластомы?

Ответ: р ≈ 0,253.

Задача 10. Дальтонизм — рецессивное, сцепленное с Х-хромосомой заболевание. Частота аллеля, определяющего дальтонизм, составляет 0,08. Во сколько раз чаще встречается дальтонизм у мужчин, чем у женщин?

Решение:

Для изучения частот генов и генотипов при сцепленном с полом наследовании

используют формулы: p(ХA) + q(Хa)=1

0,5 ∙ p2 (ХAХA) + pq (ХАХa) + 0,5 ∙ q2 (Хa Ха) + 0,5 ∙ р (XAY) + 0,5 ∙ q (XaY) = 1

с помощью второй формулы, высчитаем частоту встречаемости дальтонизма у мужчин: 0,5 ∙ q (ХаY) = 0,5 ∙ 0,08 = 0,04

Частота дальтонизма среди женщин: 0,5 ∙ q2 (Хa Ха) = 0,5 ∙ 0,082 = 0,0032

0,5 ∙ q/ 0,5 ∙ q2 = 1/q = 1/0,08 = 15,5 раз

Ответ: частота дальтонизма у мужчин в 12,5 раз больше, чем у женщин.