Б. Прижизненное исследование клеток в организме (in vivo)

1. Наблюдение структур в живом организме. Пример: с помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюминаторов можно наблюдать циркуляцию крови в микрососудах.

2.Метод вживления прозрачных камерв организм животного. Исследуемый объект помещается в прозрачную камеру (снабженную микроотверстиями для осуществления обмена веществ) и вживляется, чаще всего, в ушную раковину экспериментального животного. С помощью микроскопа можно наблюдать динамику изменения клеток и тканей в течение длительного времени.

3.Метод использования естественных прозрачных камер экспериментального животного, например передней камеры глаза, расположенной между роговицей и радужкой. Такой метод был использован для изучения ранних стадий развития зародыша, циклических изменений эндометрия и др.

4. Метод трансплантации – широко используется для изучения кроветворения. Клетки крови и костного мозга от здоровых животных пересаживаются животным, подвергнувшимся смертельному облучению. Экспериментальные животные выживают вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток (метод колониеобразования). Этим методом установлены источники развития для всех клеток крови.

Так как ткани в организме имеют приблизительно одинаковый коэффициент лучепреломления, то иногда с целью их дифференцировки прибегают к использованию прижизненных красителей.

К прижизненным красителям относятся: метиленовый синий, трипановый синий, конго-красный.

Прижизненные красители должны отвечать следующим требованиям:

1. Быть безвредными для организма.

2. Быстро выводиться из организма.

Окрашивание живых объектов имеет две разновидности:

1. Витальное (прижизненное окрашивание) - краситель вводят в организм животного, где он избирательно связывается с определенными клетками, органеллами, межклеточным веществом… Например,трипановый синийилилитиевый карминвыявляют фагоциты;ализарин– новообразованный матрикс кости.

2. Суправитальное окрашивание– окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом красителембриллиантовым крезиловым синим выявляются молодые эритроциты (ретикулоциты),янусом зеленым – митохондрии,нейтральным красным – лизосомы.

II посмертные методы

Основным объектом посмертного метода исследования является гистологический препарат. Препарат может представлять собой:

- мазок (крови, костного мозга, слюны…)

- отпечаток (селезенки, печени, тимуса…)

- пленку (брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки…)

- срез

- шлиф (зуба, кости…)

Наиболее часто используют тонкие окрашенные срезы, заключенные в бальзам – так называемый постоянный гистологический препарат.

Приготовление постоянного гистологического препарата

Основными этапами приготовления гистологических препаратов являются следующие:

1. Взятие материала.

2. Фиксация.

3. Промывка.

4. Обезвоживание.

5. Заделка в уплотняющие среды.

6. Приготовление срезов.

7. Окраска срезов.

8. Обезвоживание, просветление и заключение среза в канадский либо пихтовый бальзамы для длительного хранения.

1. Взятие материала для приготовления препарата от живого организма (биопсия) или от трупа (аутопсия). Объект не должен превышать 1 см3.

2.Фиксацию объекта производят с целью сохранения структуры ткани либо органа, частичного уплотнения и предохранения от порчи. Учитывая выше изложенное, фиксаторы должны отвечать следующим требованиям:

а) не должны изменять структуры объекта,

б) должны свертывать белки,

в) быть бактерицидными.

Фиксаторы различают простые и сложные.

К простым относятся однокомпонентные: формалин (раствор формальдегида в воде), алкоголь, сулема и др.

К сложным фиксаторам относятся фиксаторы, состоящие из нескольких компонентов. Например: 1. Ценкер-формоловая смесь (сулема, формалин, бихромат калия, вода, сернокислый натрий). Каждый компонент этой смеси улучшает качество другого. Например: сулема является очень хорошим фиксатором, но плохо пропитывает ткани; бихромат калия, наоборот, слабый фиксатор, но зато хорошо пропитывает ткани. В сочетании они дополняют друг друга. 2. Жидкость Карнуа (спирт, формалин, ледяная уксусная кислота). Время фиксации зависит от вида фиксатора, вида и размера объекта и от целей, которые преследует исследователь. Варьирует оно от нескольких минут до нескольких дней и даже месяцев.

3. Промывка делается с целью освобождения от фиксатора. Производят ее в проточной воде (до 1 суток).

4. Обезвоживание производят в спиртах возрастающей крепости (от 60 до 100 градусов), чтобы предохранить ткань от быстрого сморщивания. 100 градусный спирт называется абсолютным. Абсолютная концентрация спирта достигается добавлением к 96-спирту влагопоглотителей: прокаленного медного купороса или окиси кальция.

5. Заделка в уплотняющие среды. После обезвоживания производят заделку объекта в уплотняющие среды. Такими средами являются парафин, целлоидин.

Заделка в парафин. Парафин – это твердое вещество - жировоск.

Предварительно объект из абсолютного спирта переносят в смесь спирта с каким-либо жирорастворителем (ксилол, хлороформ) в соотношении 1:1, а затем в порцию чистого жирорастворителя. После этого объект помещают в насыщенный раствор парафина в жирорастворителе с температурой плавления 37 градусов, называемый в гистологической практике снегоподобной массой. В этом растворе объект следует выдержать до 1 суток. Затем объект на несколько часов последовательно переносят в 2 порции чистого парафина с температурой плавления 54-56 градусов (в термостате). После того как объект достаточно пропитался парафином, формируют парафиновый блок путем заливки объекта чистой порцией парафина в специальной формочке с последующим быстрым охлаждением.

а) парафиновая заливка дает возможность получить тонкие равномерные срезы (2-7 мкм);

б) парафиновая заливка дает возможность получить серию срезов, что необходимо для послойного изучения объекта.

6. Приготовление срезов производят на специальных приборах – микротомах. Различают микротомы: а) санные,

б) швейные (ротационные).

В санном микротоме блок укрепляется неподвижно в объектодержателе, а микротомный нож, проходя над ним, делает срезы. В микротоме есть микрометрический винт, соединенный с объектодержателем. Каждый поворот винта вызывает соответственное перемещение вверх объектодержателя с объектом на заданное расстояние (заданная толщина среза).

В швейном микротоме, наоборот, микротомный нож закреплен неподвижно, а объектодержатель с объектом подвижно.

Полученные парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло с помощью яичного белка или легкого подогревания на спиртовке или в термостате.

7. Окраска срезов. Окрашивание срезов производится с целью увеличения контрастности изучаемых структур. Для этого срезы необходимо депарафинировать: удалить парафин погружением стекол в ксилол, а затем избавиться от ксилола последовательной промывкой в спирте и воде.

Краска наносится на срез на несколько минут, затем смывается водой. Обычно используется комбинированная окраска с использованием двух или нескольких красителей, избирательно окрашивающих различные структуры, например: гематоксилин (ядра) + эозин (цитоплазма).

8. Заключение объекта для длительного хранения.

После окрашивания срезы промывают водой, обезвоживают спиртом, спирт удаляют ксилолом, который одновременно делает срезы прозрачными. Затем на срезы наносится капля канадского либо пихтового бальзама, после чего он покрывается покровным стеклом и подсушивается. Такие постоянные гистологические препараты могут храниться в течение длительного времени.