11,12, 14

Методы исследования в микробиологии. Принципы организации, аппаратура и режим работы бактериологической, вирусологической, иммунологической лабораторий. Общие правила взятия, хранения и пересылки материала при микробиологических исследованиях.

Бактериоскопический (микроскопический) метод исследования – совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных свойств МБ в исследуемом материале с помощью микроскопии.

Основные цели: 1) установление этиологии болезни 2) морфологическая идентификация возбудителя 3) определение чистоты выделенной чистой культуры.

Оценка метода: метод простой, широко доступный, быстрый, экономичный, но мало чувствителен, мало специфичен (морфология МБ разных видов часто схожа) и небезопасен.

Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Биологический (экспериментальный) метод исследования - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных.

Молекулярно-генетические методы исследования:

Молекулярная гибридизация - процесс, в котором одноцепочечная НК исследуемого микроорганизма (мишень) при взаимодействии с комплементарным фрагментом НК., включающей метку (зонд), образует двухцепочечный комплекс.

Назначение метода: выявление степени сходства различных ДНК.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) - что способ быстрого получения множественных копий специфической последовательности ДНК бактерий, грибов, вирусов до количества, достаточного для идентификации другими молекулярно-биологическими методами.

ТРАНСПОРТИРОВКА:

Образцы материала собирают в стерильную посуду, которую маркируют, помещают в специальные биксы или пеналы и направляют в лабораторию.

В сопроводительном документе (направлении) приводят сведения о характере материала, времени его взятия, данные о больном, включающие предполагаемый клинический диагноз и перечисление антибиотиков, использованных в лечении, указывают название учреждения, отделения, направляющего материал.

Транспортировку материала для исследования осуществляют в предельно сжатые сроки. Охлаждение материала в холодильнике при t° 4° (или на льду) позволяет увеличить время до начала исследования на 30—60 мин. Более длительное хранение может привести к гибели возбудителей или изменению количественных соотношений частей микрофлоры. Поэтому в случаях, когда хранение и транспортировка длятся более суток, используют консервант или транспортные (поддерживающие, накопительные) среды и специальные средства, сохраняющие жизнедеятельность микроорганизмов.

БАКТЕРИОЛ. ЛАБ. при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы. Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются:

- выделения из организма человека: моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкость и трупный материал;

- объекты внешней среды: вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т. п.

В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и заражённой посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, розлива, стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

В лаборатории имеется место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы красок, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и пр. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами.

Аппаратура для выращивания микроорганизмов, стерилизации и других микробиологических целей

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37°С. Термостаты бывают суховоздушными и водяными. Используются для культивирования микроорганизмов.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

4. Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

5. Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4°С. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С используются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20°С и ниже.

13. Методы окраски. Окраску мазка производят просты­ми или сложными методами. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, ис­пользуя красители анилинового ряда (основные или кис­лые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромо­фор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кис­лые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Ос­новные красители — генциановый фиолетовый, кристал­лический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят на­сыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спирто­вые, которые и служат для окрашивания микробных кле­ток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Ес­ли мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изуче­ния структуры клетки и дифференциации микроорганиз­мов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсион­ной системе. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воз­действия на них каких-либо источников энергии: световых, элек­тронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесцен­ция — люминесценция объекта под влиянием света. Если осве­щать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В ре­зультате возникает цветное изображение объекта.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зре­ния основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в био­логическом микроскопе .

Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объек­та на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно­сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмик­роскопических объектов. И стр.9 практикум