- •Общая вирусология методические указания
- •111801-65 - «Ветеринария» и 111900.62 – «Ветеринарно-
- •Занятие №1
- •Для выполнения этих требований необходимо:
- •Заражение
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №2
- •Транспортировка и хранение проб.
- •Подготовка вируссодержащего материала для исследования.
- •Подготовка органов и тканей.
- •Подготовка выделений из носа, глаз.
- •Подготовка фекалий.
- •Подготовка крови.
- •Отбор крови для серологических исследований.
- •Методы очистки вируссодержащего материала.
- •Биологический метод очистки.
- •Методы концентрации вирусов в рабочей суспензии.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №3 Световая вирусоскопия.
- •Окраска по Романовскому
- •Окраска по методу Муромцева
- •Окраска по методу Михина
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №4 Люминесцентная вирусоскопия и методы флуорохромирования препаратов.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №5 Электронная вирусоскопия.
- •Устройство микроскопа (основные узлы)
- •Приготовление объекта и требования, предъявляемые к нему в связи с электронной микроскопией.
- •Общая схема препарирования состоит из операций:
- •Приготовление подложек
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие 6 Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Культивирование вирусов в эмбрионах кур. Схема эмбрионов кур. Освоение методов заражения эмбрионов кур.
- •Лабораторные животные должны отвечать определенным требованиям:
- •Лабораторных животных используют для:
- •Методы экспериментального заражения лабораторных животных.
- •Методы заражения куриных эмбрионов
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие 7 Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие № 8 Культивирование вирусов на культуре клеток.
- •Культуры клеток применяются для:
- •Техника приготовления однослойной первично трипсинизированной культуры клеток из фибробластов 9-10 суточных куриных эмбрионов.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Занятие 9 Методы заражения культур клеток. Цитопатогенное действие вируса на клетку.
- •Подбор культур клеток.
- •Техника заражения культур клеток.
- •Применяют 2 способа заражения.
- •Цпд используется для:
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Литература
- •Оглавление
Занятие №2
Отбор, консервирование и транспортировка патологического материала.Приготовление рабочей суспензии. Методы очистки и концентрации вирусов в исследуемом материале.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: научить студентов отбору, консервированию и
транспортировке патологического материала, технике приготовления 10% рабочей суспензии из патологического материала, методам очистки и концентрации вирусов в исследуемом материале.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:
- Стерильные ступки и пестики - 5 шт.;
- свежий исследуемый патологический материал (10-15 г.);
- ножницы, скальпели, пинцеты в стаканах - - 5 шт.;
- чистые пробирки с резиновыми пробками-10 шт.;
- стерильный речной песок или порошок стекла - 5 шт.;
- воронки и бумажные фильтры -10 шт.;
- сосуд с дезраствором;
- антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин);
- пастеровские пипетки -10 шт.;
- мерные пипетки на 10 мл и 1 мл - 10 шт.;
- питательные среды-МПА, МПБ, сусло-агар - 2 шт.;
- фильтры ВГНКИ, Зейтца, Шамберлана;
- спиртовки - 5 шт.;
- физиологический раствор - 5 шт.
В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия патологического материала, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вируссодержащего материала, которые имеют свои особенности.
Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2-3 ч после клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или впервые 1-2 дня значительно ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссеминации кишечной флоры. Кроме того, по мере продолжения и даже углубления инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма.
При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения и пути выделения). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных - кал; при нейротропных - кусочки головного или спинного мозга; при дермотропных инфекциях - свежие поражения кожи, то есть отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и др.
Кровь берут из яремной вены, у свиней - из кончика хвоста или уха. Лучше кровь у свиней брать из венозного сплетения глаз. При этом пользуются шприцем «Рекорд» (на 20 мл) и иглой № 12-30, которую вводят по внутреннему углу костной орбиты (скосом иглы к костной орбите) к противоположному уху до упора, затем оттягивают на 1-1,5см и набирают кровь.
Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лайковая» кровь (смесь крови с дистиллированной водой в соотношении 1:1), либо отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка). Для обнаружения противовирусных антител кровь берут у одного и того же животного дважды с интервалом 2-3 недели (для получения парных сывороток в объеме не менее 5,0 мл каждой).
Смывы с конъюнктивы, со слизистой оболочки носа, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (ИГЛА, 199) с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ЕД. и нистатин по 20 ЕД. на 1 мл среды) и белковым стабилизатором, например 0,5%-ным раствором желатина или 0,5-1%-ым раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов (например, парагриппа).
При взятии материала из носоглотки можно пользоваться прибором, сконструированным Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9мм и длиной 30см, внутри которой помещается вторая тонкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой (диаметр 9мм). Прибор вводят глубоко в носовые КОДЫ (хоаны) или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, затем вновь задвигая ее в трубку, перед тем как вынуть прибор из органа. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости.
Слюну имеет смысл брать при наличии признаков поражения ротной полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный тампон из ваты на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим количеством физиологического раствора и закрыть резиновой пробкой. Для усиления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02-0,05г на 1кг массы.
Мочу собирают при помощи катетера в стерильную посуду.
Фекалии берут из прямой кишки шпателем или палочкой и помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон.
Везикулярную жидкость можно собрать шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом.
Спинномозговую жидкость используют редко. Ее берут асептично путем обычной пункции.
После смерти животного важно как можно быстрее взять кусочки органов, так как при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется столь незначительным, что обычными рутинными методами исследования выделить его не удается. Вторая причина необходимости экстренного взятия материала заключается в том, что в трупе быстро развивается бактериальное обсеменение, взять пробу стерильно становится невозможно.
В экспериментальных условиях инфекционный материал берут главным образом у животных, убитых в агональный период болезни.
Применение антибиотиков эффективно лишь при условии незначительного бактериального загрязнения проб. Однако при различных посмертных изменениях тканей, если даже при помощи антибиотиков удается затормозить рост бактерий, нельзя нейтрализовать продукты их метаболизма и токсические субстанции поврежденной ткани. Такой материал непригоден для проведения исследований ни на животных, ни тем более на куриных эмбрионах и культурах клеток. По тем же причинам пробы должны быть взяты по возможности в стерильных условиях. Особенно тщательно следует избегать загрязнения проб содержимым пищеварительного тракта, так как в нем могут находиться непатогенные вирусы, которые вызывают деструкцию клеточных культур, осложняя тем самым диагностические исследования.
В качестве патматериала берут кусочки органов размером в несколько кубических сантиметров и массой 10-20г, которые имеют видимые отклонения от нормы (по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований); могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни перед смертью.
Наиболее часто содержат вирус печень, селезенка, легкие, головной мозг, лимфатические узлы, почки.