- •Общая вирусология методические указания
- •111801-65 - «Ветеринария» и 111900.62 – «Ветеринарно-
- •Занятие №1
- •Для выполнения этих требований необходимо:
- •Заражение
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №2
- •Транспортировка и хранение проб.
- •Подготовка вируссодержащего материала для исследования.
- •Подготовка органов и тканей.
- •Подготовка выделений из носа, глаз.
- •Подготовка фекалий.
- •Подготовка крови.
- •Отбор крови для серологических исследований.
- •Методы очистки вируссодержащего материала.
- •Биологический метод очистки.
- •Методы концентрации вирусов в рабочей суспензии.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №3 Световая вирусоскопия.
- •Окраска по Романовскому
- •Окраска по методу Муромцева
- •Окраска по методу Михина
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №4 Люминесцентная вирусоскопия и методы флуорохромирования препаратов.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие №5 Электронная вирусоскопия.
- •Устройство микроскопа (основные узлы)
- •Приготовление объекта и требования, предъявляемые к нему в связи с электронной микроскопией.
- •Общая схема препарирования состоит из операций:
- •Приготовление подложек
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие 6 Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Культивирование вирусов в эмбрионах кур. Схема эмбрионов кур. Освоение методов заражения эмбрионов кур.
- •Лабораторные животные должны отвечать определенным требованиям:
- •Лабораторных животных используют для:
- •Методы экспериментального заражения лабораторных животных.
- •Методы заражения куриных эмбрионов
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие 7 Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Занятие № 8 Культивирование вирусов на культуре клеток.
- •Культуры клеток применяются для:
- •Техника приготовления однослойной первично трипсинизированной культуры клеток из фибробластов 9-10 суточных куриных эмбрионов.
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Занятие 9 Методы заражения культур клеток. Цитопатогенное действие вируса на клетку.
- •Подбор культур клеток.
- •Техника заражения культур клеток.
- •Применяют 2 способа заражения.
- •Цпд используется для:
- •Самостоятельная работа студентов:
- •Контрольные вопросы:
- •Литература
- •Оглавление
Культуры клеток применяются для:
1. Обнаружения вируса в исследуемом патологическом материале на ЦПД.
2. Идентификации вируса, обнаружение специфических антител в исследуемых сыворотках крови и определение их титров по реакции нейтрализации на КК.
3. Накопления вируса для производства культуральных живых и убитых вирус вакцин.
4. Получения вирусных антигенов-диагностикумов для серологической диагностики вирусных заболеваний.
5. Постановки РГАд, РЗГАд, РН.
6. Изучения особенности дегенерации клеток (ЦПД) под действием различных вирусов.
Культуры клеток делятся на плазменные, однослойные первично трипсинизированные, субкультуры, диплоидные, перевиваемые, суспензионные, культуры переживающих тканей.
1. Плазменные культуры клеток - это мелкие кусочки эмбриональной ткани, величиной 1-1,5 мм, залитые плазмой куриной крови, которая служит питательной средой для клеток.
Живые клетки в питательной среде размножаются, отторгают мертвые клетки.
Плазменные культуры клеток считаются подготовленными к работе, когда вокруг тканевых кусочков образуется ореол живых клеток, которые используются для культивирования вируса.
В последние годы плазменные КК применяются редко, т.к. в этой культуре много мертвых отторгнутых клеток, что затрудняет учет ЦПД.
2. Однослойные первичные трипсинизированные культуры клеток - это клетки однократного применения. Они не пересеиваются на новую питательную среду. Срок жизни этих клеток в рабочей суспензии при температуре + 2°С - + 4°С 20-25 дней, в питательной среде при температуре +37°С 5-6суток после образования клеточного монослоя. Монослой формируется через 2-4 суток в зависимости от исходного материала и других факторов.
Исходная концентрация клеток для формирования нормального монослоя должна быть не ниже 500-600 тысяч в 1 мл питательной среды. Подсчет клеток проводится в камере Горяева по лейкоцитарной формуле. В течение 1-2 часов клетки адаптируются к питательной среде, затем в течение 2-3 суток активно размножаются образуя сплошной клеточный слой. Пробирки, флаконы, матрасы, баллоны с выросшим густым монослоем прозрачных клеток сразу не используют для вирусологической работы.
Методика приготовления однослойных трипсинизированных КК, весьма трудоемка. Люди 5-6 часов работают в стерильном боксе, в стерильных халатах, масках у пламени спиртовки и тем не менее эти культуры клеток наиболее широко применяются в практике вирусологических лабораторий.
3. Субкультуры - это линии первично трипсинизированных КК, которые можно 3-4 раза пересеивать на новую питательную среду и таким образом использовать их для работы в течение месяца.
4. Диплоидные культуры клеток - это особые клетки, выделенные из организма животных, имеющие диплоидный (двойной) набор хромосом. Они очень жизнестойкие и их можно пересевать (перевивать) из одной среды в другую в течение 5-6 месяцев.
5. Перевиваемые культуры клеток - это клетки мутанты, выделенные из организма животных, обладающие способностью к активному, не ограниченному размножению на специальных питательных средах. Их можно перевивать (пересеивать) из одной среды в другую бесконечно долго, что делает эту культуру клеток очень удобной живой лабораторной моделью для культивирования многих вирусов.
Первые линии перевиваемых КК были получены из доброкачественных и злокачественных опухолей. Однако опухоли имеют вирусное происхождение, т.е. инфицирование опухолеродными вирусами, поэтому опухолевые клетки применяются редко. Ученые получили специальные перевиваемые линии клеток, обладающие такой же высокой скоростью беспредельного размножения, как и опухолевые клетки, но они свободны от вирусной инфекции.
6. Суспензионные культуры клеток - это клетки, которые активно размножаются в питательной среде, но не фиксируется на стекле, т.е. не образуют клеточный монослой, а накапливаются во взвешенном состоянии в среде. Они также являются хорошей живой моделью для культивирования вируса.
Все культуры клеток выращиваются в специальной ростовой питательной среде в термостате при температуре 37°С. После образования монослоя через 5-6 суток клетки стареют и погибают в результате интенсивной дегенерации и накопления продуктов клеточного обмена. Поэтому выросшие КК сразу же пускают в работу. Продлить жизнедеятельность клеток на 5-10 суток можно путем помещения их в условия холодильника при температуре + 2°С - +4°С. Не использованные культуры перевиваемых и диплоидных клеток, через каждые 8-10 дней хранения перевивают на новую питательную среду для поддержания этих клеток в рабочем состоянии.
Питательные среды для КК бывают естественными и искусственными, ростовыми и поддерживающими. Естественной питательной средой для некоторых клеток являются коровий эмбриональный экстрат, коровья амниотическая жидкость. В настоящее время естественные питательные среды для КК не применяются, а используются специальные искусственные среды. Искусственные питательные среды имеют сложный состав, содержат более 60 различных компонентов : макро, микроэлементов, ростовых факторов, набор необходимых аминокислот, углеводов, витаминов, гормонов и т.д. Прообразом искусственных питательных сред для КК явилось молозиво, которое содержит все необходимое для питания новорожденных, их роста и развития. Однако до настоящего времени качественный и количественный состав компонентов молозива изучен не достаточно, а поэтому питательные среды для КК не могут в полной мере заменить среду живого организма, поэтому клетки сравнительно быстро стареют и погибают.
Ростовые питательные среды содержат белок, который обеспечивает рост и развитие клеток.
Поддерживающие питательные среды не содержат белка, клетки в этой среде не размножаются, а только сохраняют жизнеспособность. Поэтому выращивают клетки (КК) в ростовой питательной среде, затем, когда сформируется сплошной клеточный монослой, ростовую питательную среду заменяют поддерживающей и дальнейшее размножение клеток прекращается.
Биологическая промышленность выпускает поддерживающие среды, например: наша отечественная 0,5%;2%;5% гидрализат лактоглобулина, среда Игла и другие. Чтобы эти среды стали ростовыми к ним добавляют 10-15% стерильной сыворотки крови животных.
Питательные среды для КК обычно подкрашены нейтральным красным, который при изменении рН по мере накопления продуктов обмена веществ клеток меняет цвет, что является сигналом для замены питательной среды и пересева.
Кроме питательных сред для изготовления КК необходимы сбалансированные солевые растворы – фосфатно-буферный раствор, раствор Хенкса, в которых отмывают от крови (эритроцитов) тканевые кусочки, разводят вирус для заражения КК.
Пропись фосфатно-буферного раствора состоит из 2 растворов "А" и "Б", которые перед работой соединяют.