Техника приготовления однослойной первично трипсинизированной культуры клеток из фибробластов 9-10 суточных куриных эмбрионов.

1. Путем овоскопии отбирают наиболее жизнеспособные эмбрионы, с активным сокращением и густой сетью кровеносных сосудов на хорионалантоисной оболочке карандашом отмечают пугу. Дальнейшая работа проводится в стерильном боксе, в халатах, масках, головных уборах, стерильными инструментами.

2. Скорлупу эмбриона дезинфицируют и обжигают спиртом или ио­дированным спиртом. Затем срезают скорлупу по границе пуги.

3. Пинцетом извлекают из яйца эмбрион и помешают его в чашку Петри с фосфатно-буферным раствором или раствором Хенкса. От тушки отделяют голову, конечности, внутренности и тщательным ополаскиванием отмывают от эритроцитов, в 2-х порциях солево­го раствора. В КК не должно быть эритроцитов, иначе ведь ви­рус после ее заражения адсорбируется на эритроцитах и не пойдет в клетки.

4. Затем тушку переносят в стерильный стакан (флакон) и ножницами мелко ее измельчают.

5. Тканевую суспензию переносят в колбу с теплым 0,25% раствором трипсина, опускают в нее стерильный магнит, запаянный в стеклянную и полихлорвиниловую и ставят на электромагнитную мешалку на 15-20 минут. За это время трипсин, как протеолитический фермент, растворяет оболочку клетки от тканевых кусоч­ков.

6. Затем раствор трипсина с клетками фильтруют через 2-3-й слой марли в стерильный флакон.

7. Полученную клеточную взвесь разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 10-15 минут со скоростью не более 400-500 оборотов в минуту, чтобы механическим давлением не разрушить клетки.

К тканевому осадку снова добавляют теплый раствор трипси­на, ставят на электромагнитную мешалку и процесс повторяется до тех пор полка все тканевые кусочки не превратятся в клетки.

8. После центрифугирования на дне оседает светло-розовый слой клеток. Раствор трипсина сливают, к осадку добавляют питательную среду, осадок острожно встряхивают и переносят в кол­бу с ростовой питательной средой. Клеточную взвесь дополнительно пипетируют (ресуспензируют) стерильной пипеткой.

9. Определяют исходную концентрацию клеток в камере Горяева по формуле подсчета лейкоцитов. Доводят до нужной концентрации 600-800 тысяч клеток в 1 мл.

10. Подготовленную клеточную взвесь разливают по 1мл в стерильные пробирки, плотно закрывают пробками и ставят маркером по стеклу продольную черту на пробирке и укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6° чертой вверх. Черта является ориентиром, что на противоположной стороне пробирки формируется клеточный монослой. Штатив с пробирками помещают в термостат при температуре 37°С на 2-3 суток.

11. Ежедневно в специальном горизонтальном штативе проводят микроскопию КК при малом увеличении. Для этого пробирку фиксируют чертой вниз и определяют время формирования густого монослоя клеток.

По аналогичной методике готовят первичные или трипсинизированные КК из органов лабораторных, сельскохозяйственных животных или из органов молодых убитых животных. Для приготовления культуры клеток применяется специальная методика подготовки посуды.