3.2.2. Обработка и оценка результатов эксперимента на Ceriodaphnia affinis

Для определения наличия острого действия растворов исследуемых веществ на цериодафний рассчитывают летальность (L, %) рачков для каждой концентрации и находят медиальную летальную концентрацию.

Летальность (L, %) рассчитывается по формуле:

где X_K – число выживших особей в контроле, шт.;

X_о – число выживших особей в тестируемой воде, шт.

В случае гибели дафний в контроле от 5 до 20 %, вносят поправку в результаты по формуле Аббота:

Результаты всех повторностей суммируются, и определяется средняя смертность организмов в данной концентрации токсиканта. По ней рассчитываются величины LC₅₀ за 48 часов и определяются действующие концентрации веществ по наличию статистически достоверного снижения величины выживаемости цериодафний в опыте по сравнению с контролем.

Достоверность полученных результатов считается надежной, если удовлетворены следующие условия:

1. гибель контрольных цериодафний не превышает 10 %;

2. LC₅₀ бихромата калия за 24 часа для цериодафний в возрасте (6±2) часов находится в интервале 1,0-2,2 мг/л;

3. содержание растворенного кислорода в исследуемых растворах, определенное в конце опыта, не ниже 5,0 мг О₂/л [54, 55, 57].

Медиальная летальная концентрация (LC₅₀) определяется с помощью графического метода. Он основан на определении LC₅₀ по кривой летальности или характеристической кривой, отражающей распределение индивидуальной устойчивости животных к исследуемому токсическому агенту.

Характеристическая кривая строится путем нанесения концентраций или логарифмов концентраций по оси абсцисс, а процента летальности – по оси ординат. В полуграфическом виде эта зависимость близка к прямой. От точки на оси ординат, соответствующей 50 % смертности, проводится линия, параллельная оси абсцисс. Из точки пересечения этой линии с опытной прямой опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Полученная концентрация разбавления С_х и будет соответствовать искомой величине LC₅₀. Медиальную летальную концентрацию можно найти, решив уравнение, описывающее характеристическую кривую. Чем больше LC₅₀, тем токсичнее тестируемое вещество.

Зависимость между концентрацией и эффектом (в данном случае процентом гибели животных) при графическом изображении должна иметь вид S-образной кривой. При логарифмировании концентраций кривые становятся более симметричными [56].

3.3. Эксперимент на смешанной культуре Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda

3.3.1. Методика проведения острого опыта на смешанной культуре Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda

Методика основана на регистрации снижения темпов роста (снижение численности) клеток водорослей Chlorella vulgarisиScenedesmus quadricaudaпод воздействием токсических веществ, присутствующих в тестируемой воде (опыт), по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ (контроль).

Критерием острой токсичности является снижение численности клеток водорослей на 50 % и более, по сравнению с контролем в течение 96-часовой экспозиции.

В экспериментах по определению острой токсичности устанавливают:

1. ингибирующую концентрацию, вызывающую снижение численности клеток водорослей на 50 % и более, по сравнению с контролем за 96 часов экспозиции;

2. безвредную концентрацию, вызывающую снижение численности клеток водорослей не более чем на 20 %, по сравнению с контролем за 96 часов экспозиции.

Характеристики степени токсичности используемой воды приведены в таблице 13:

Таблица 13. Оценка токсичности воды.

Отклонение от контроля, %	Оценка
до 20	Нетоксичная
от 50 и более	Острая токсичность

Длительность эксперимента – 4 суток. Для эксперимента используются культуры, находящиеся в начальной фазе логарифмического роста (через 3-5 суток после перенесения в новую культуральную среду). Начальная плотность водорослей в контроле и опыте – в пределах 20-50 тыс. кл/мл.

Опыты ставятся в трех повторностях. Для учета возможного эффекта растворителя на водоросли ставится второй контроль, в который добавляются эквивалентные количества растворителя. Общий объем жидкости в колбах составляет 40 мл, из них 12 мл – питательная среда Успенского №1 (KNO₃– 0,025 г/л,MgSO₄– 0,025 г/л,Ca(NO₃)₂– 0,1 г/л,KH₂PO₄– 0,025 г/л,K₂CO₃– 0,0345 г/л); 8 мл – суспензия водорослей. Обязательное условие для постановки опыта – добавление питательной среды из такого расчета, чтобы через 4-5 суток численность водорослей возросла, по крайней мере, в 2 раза.

Питательную среду стерилизуют в автоклаве (0,5 ч при 1 атм.) или сухим жаром (1 ч при 18^oС), а при отсутствии автоклава – кипячением на медленном огне на водяной бане.

Водоросли выращивают в стерильных колбах емкостью 0,25-0,5 л, закрытых ватно-марлевыми пробками, которые сверху прикрываются колпачками из стерильной пергаментной бумаги или полиэтиленовой пробкой. Для предотвращения оседания клеток на дно и их прикрепления к стенкам, а также для лучшего растворения углекислого газа, содержимое колб не менее двух раз в сутки перемешивают, избегая намокания пробок.

Оптимальный режим предусматривает культивирование водорослей при температуре (20±2)^oC в люминостате при естественном освещении и досвечивании в течение 12 часов в сутки лампами дневного света с общей освещенностью 3-5 тыс. лк. Повышение температуры до 25^oС и выше усиливает действие токсиканта, поэтому культивировать водоросли и проводить опыты следует в термостатируемых установках. Колбы с водорослями размещают в люминостате так, чтобы освещение было равномерным снизу или сверху при удалении источника от колб на 30-40 см во избежание их перегрева.

При отсутствии термостатируемых условий опыты могут проводиться с размещением колб на окне при естественном освещении, но с защитой от прямых солнечных лучей.

Соответствующие наблюдения и анализы проводят ежедневно в течение четырех дней после постановки эксперимента. Оценивают число живых клеток в камере Горяева. При работе с ней просчитывают число клеток в 25 больших квадратах, а затем проводят пересчет на 1 см³по формуле: х=m•10⁴, где х – общее количество клеток в 1 см³; m – количество клеток в 25 больших квадратах. Для определения живых и мертвых клеток используют краситель – метиленовую синь и нейтральный красный. К 1 мл суспензии водорослей добавляют 1 мл метиленовой сини и нейтрального красного в разведении 1:5000. Растворы красителей и суспензии водорослей тщательно перемешивают и через 20 минут микроскопируют. При смешении двух красок мертвые клетки окрашиваются в фиолетовый цвет. Живые клетки имеют зеленую окраску.