2.2.Токсикологический эксперимент.
Основная задача любого токсикологического опыта – определение максимальной недействующей (или безвредной, пороговой, неэффективной) концентрации веществ, при которой не обнаруживается изменений в организмах. При проведении опытов с различными тест-объектами (рыбами, беспозвоночными и т.д.) устанавливают безвредную концентрацию вещества для наиболее чувствительного организма, которая служит отправной точкой для определения допустимой концентрации этого вещества.
Тест-организмы – это высокочувствительные организмы, широко представленные в определенных географических зонах, доступные для сбора, удобные для содержания и культивирования в лаборатории и хорошо изученные.
В качестве объектов исследования для данной дипломной работы были выбраны соединения – нитроароматические соединения и их производные аминоароматические соединения, поскольку эти соединения находят очень широкое применение, однако их биологическое действие еще недостаточно изучено. Поэтому изучение токсичности данных соединений является актуальной задачей. Для оценки степени токсичности выбранных соединенийи проведениятоксикологического эксперимента нами были выбраны в качестве тест-объектов рачки Ceriodaphnia affinisи смешанная культура водорослей (Chlorella vulgarisиScenedesmus quadricauda).
Таблица 6. Структурные формулы и названия исследуемых соединений.
|
№ п/п |
Название соединения |
Структурная формула |
|
1 |
4-Хлорнитробензол
|
|
|
2 |
4-хлорнитроанилин |
|
|
3
|
4-хлор-3-нитроанилин
|
|
|
4
|
2,4-динитрохлорбензол
|
|
|
5
|
2,4-диаминохлорбензол
|
|
|
6
|
2-хлор-4-нитроанилин
|
|
У всех веществ во втором и четвертом положении находятся функциональные группы – амино- и нитрогруппы . Данные функциональные группы обладает сильным электронстягивающим эффектом, что приводит к изменению электронной структуры и свойств (физических, химических и токсических) исследуемых соединений. Следовательно, при рассмотрении токсичности нитро и аминоароматических, нас в первую очередь будет интересовать вопрос о влиянии количества заместителей и их местоположения на токсические свойства исследуемых веществ.
Для оценки степени токсичности и проведениятоксикологического эксперимента нами были выбраны в качестве тест-объекта рачки Ceriodaphnia affinis.
2.2.1. Экспериментальные данные по биологической активности амино- и динитроарен.
2.2.1.1. Эксперимент на цериодафниях.
Для исследуемого ряда химических соединений проводили токсикологический эксперимент на Ceriodaphnia affinis.Острый опыт ставили из пяти концентраций, в течение 48 часов, в трех повторностях для каждой концентрации и в условиях, описанных в методике [54, 55, 57]. Для контроля использовали отстоянную воду с растворителем (ДHФА), коэффициент разбавления тот же, что и в опыте. Модельные (рабочие) растворы готовились на отстоянной - культивационной(биологинизированной) воде путем разбавления основного(маточного) раствора в 2nраз, где n=1(100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3; 1,5).
Через двое суток проводили подсчет выживших особей в контрольном и опытных вариантах для каждой концентрации. Результаты опытов отражены в таблице 7:
Таблица 7. Результаты эксперимента на Ceriodaphnia affinis.
|
Соединение |
Концентрация, мг/л |
Число выживших особей |
|
L,% |
LC50, мг/л | ||
|
N1 |
N2 |
N3 | |||||
|
1 |
100 |
0 |
1 |
0 |
0,33 |
94,5 |
25,87 |
|
50 |
2 |
3 |
2 |
2,33 |
61,17 | ||
|
25 |
4 |
3 |
3 |
3,33 |
44,5 | ||
|
12,5 |
5 |
6 |
5 |
5,33 |
11,73 | ||
|
6,25 |
6 |
6 |
5 |
5,67 |
5,5 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
0,0 | ||
|
2 |
25 |
1 |
2 |
1 |
1,33 |
77,83 |
15,27 |
|
12,5 |
4 |
3 |
4 |
3,67 |
38,83 | ||
|
6,25 |
4 |
5 |
4 |
4,33 |
27,33 | ||
|
3 |
5 |
6 |
5 |
5,33 |
11,73 | ||
|
1,5 |
5 |
6 |
6 |
5,67 |
5,5 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
0,0 | ||
|
3 |
25 |
2 |
2 |
2 |
2 |
66,67 |
11,95 |
|
12,5 |
2 |
3 |
3 |
2,67 |
55,5 | ||
|
6,25 |
3 |
4 |
4 |
3,67 |
38,83 | ||
|
3 |
4 |
4 |
4 |
4 |
33,33 | ||
|
1,5 |
5 |
5 |
4 |
4,67 |
22,17 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
0,0 | ||
|
4 |
50 |
1 |
0 |
0 |
0,33 |
94,18 |
15,75 |
|
25 |
2 |
1 |
1 |
1,33 |
76,54 | ||
|
12,5 |
4 |
3 |
3 |
3,33 |
41,27 | ||
|
6,25 |
5 |
5 |
6 |
5,33 |
6 | ||
|
3 |
6 |
6 |
5 |
5,67 |
5,5 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 | ||
|
5 |
50 |
1 |
0 |
1 |
0,67 |
88,83 |
20,5 |
|
25 |
2 |
3 |
2 |
2,33 |
61,17 | ||
|
12,5 |
4 |
5 |
4 |
4,33 |
27,83 | ||
|
6,25 |
6 |
6 |
5 |
5,67 |
5,5 | ||
|
3 |
6 |
6 |
5 |
5,67 |
5,5 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
0,0 | ||
|
6 |
25 |
3 |
3 |
2 |
2,67 |
55,5 |
21,23 |
|
12,5 |
4 |
4 |
3 |
3,67 |
38,83 | ||
|
6,25 |
4 |
4 |
4 |
4 |
33,33 | ||
|
3 |
5 |
4 |
4 |
4,33 |
27,83 | ||
|
1,5 |
6 |
5 |
5 |
5,33 |
11,17 | ||
|
Контроль |
6 |
6 |
6 |
6 |
0,0 | ||
На основании данных таблицы 7 с помощью программы MicrosoftExcelстроили график зависимости летальности (L, %) дафний от концентрации исследуемых соединений (мг/л).
Таблица 8. Графики зависимости летальности от концентрации исследуемых веществ.
|
№ п/п |
Графики |
LC50, мг/л |
|
1 |
|
4-хлоранилин 25,87 мг/л |
|
2 |
|
4-хлорнитробензол 15.27 мг/л |
|
3 |
|
Вещество 2,4-динитрохлорбензол 11,95 мг/л |
|
4 |
|
2хлор,5нитроанилин 15.75мг/л |
|
5 |
|
Вещество 2,4-диаминохлорбензол 20,5 мг/л |
|
6 |
|
Вещество 4хлор,3нитроанилин 21,23 мг/л |
На данных графиках показана зависимость токсичности от концентрации веществ в растворе, из которой видно, что с увеличением концентрации токсиканта увеличивается смертность особей. С помощью линии тренда подбирали функцию, описывающую эти зависимости для каждого вещества. Для всех зависимостей была подобрана полиномиальная функция второй степени, с помощью которой, приняв yза 50 и учитывая области известных значений х, решали соответствующие уравнения и получилиLC50за 48 часов в остром опыте для каждого исследуемого вещества. ЗначенияLC50за 48 часов в остром опыте сCeriodaphnia affinisдля всех производных 2,4-динитрохлорбензола приведены ниже:
вещество (1) – 25,87 мг\л
вещество (2) – 15.27 мг\л
вещество (3) – 11,95 мг\л
вещество (4) – 15.75мг\л
вещество (5) – 20,5 мг\л
6) вещество (6) – 21,23 мг\л
Таким образом видно, что при увеличении числа нитрогрупп токсичность вещества возрастает. Наиболее токсичным веществом представлен динитрохлорбензол – 11,95 мг/л, молекула которого содержит две нитрогруппы. С момента восстановления одной нитрогруппы, токсичность вещества падает. Наименьшую токсичность имеет вещество 4-хлораминобензол- 25,8 мг/л., молекула которого не содержит нитрогрупп.
Нитрогруппа, расположенная в п-положении обладает большей реакционной способностью, чем в м-положении. Этим можно объяснить, что у молекулы 2-хлор,5-нитроанилин токсичный эффект более ярко выражен, по сравнению с другими аминами.
Результаты биотестирования различных концентраций веществ показали, что выживаемость цериодафний увеличивается по мере разбавления растворов с токсикантами.
Для оценки токсичности воды использовали следующие критерии [85]:
гибель животных составляет более 50 % – вода является очень токсичной;
гибель животных составляет от 20 до 50 % – вода является токсичной;
гибель животных менее 20 % – тестируемая вода не является токсичной.
Согласно этой классификации, очень токсичной будет являться вода, которая содержит изучаемые вещества в концентрации выше LC50,т.е. более 25,87 мг/л для вещества (1), более 15,27 мг/л для вещества (2), более 11,95 мг/л для вещества (3), более 15.75 мг/л для вещества (4), более 20,5 мг/л для вещества (5), более 21,23 мг/л для вещества(6).
Затем проводили статистическую обработку полученных данных с помощью формул для малых выборок. Вычисляли среднее число выживших рачков для каждой концентрации (Xср), определяли отклонение каждого варианта от средней величины (Xi–Xср), среднее квадратичное отклонение (), ошибку среднего (m) иt-критерий Стьюдента (td).
Результаты статистической обработки полученных данных по соответствующим формулам представлены в таблице 9:
Таблица 9. Статистическая обработка результатов острого опыта на Ceriodaphnia affinis
|
Соединение |
Концентрация, мг/л |
Xср |
Σ(Xi– Xср)2 |
|
m |
Td |
|
1 |
100 |
0,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±15,254 |
|
50 |
2,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±13,254 | |
|
25 |
3,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±12,254 | |
|
12,5 |
5,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±10,254 | |
|
6,25 |
5,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±12,348 | |
|
Контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 | |
|
2 |
25 |
1,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±9,699 |
|
12,5 |
3,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±14,348 | |
|
6,25 |
4,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±11,254 | |
|
3 |
5,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±10,254 | |
|
1,5 |
5,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±12,348 | |
|
Контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 | |
|
3 |
25 |
2 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±4 |
|
12,5 |
2,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±15,348 | |
|
6,25 |
3,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±14,348 | |
|
3 |
4 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±2 | |
|
1,5 |
4,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±13,348 | |
|
Контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 | |
|
4 |
50 |
0,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±15,254 |
|
25 |
1,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±14,254 | |
|
12,5 |
3,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±12,254 | |
|
6,25 |
5,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±10,254 | |
|
3 |
5,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±12,348 | |
|
контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 | |
|
5 |
50 |
0,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±17,348 |
|
25 |
2,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±13,254 | |
|
12,5 |
4,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±11,254 | |
|
6,25 |
5,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±12,348 | |
|
3 |
5,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±12,348 | |
|
контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 | |
|
6 |
25 |
2,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±15,348 |
|
12,5 |
3,67 |
0,667 |
±0,577 |
±0,333 |
±14,348 | |
|
6,25 |
4 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±2 | |
|
3 |
4,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±11,254 | |
|
1,5 |
5,33 |
0,593 |
±0,544 |
±0,385 |
±10,254 | |
|
контроль |
6 |
0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
±0,000 |
Для данного исследования достаточна вероятность 0,95, которая соответствует уровню значимости 0,05. Число степеней свободы равно четырем (nк+nо– 2),t-критерий Стьюдента, найденный по таблице в соответствии с этими величинами, равен 2,78 [86].
Изучаемая концентрация оказывает токсическое действие на культуру Ceriodaphnia affinisв случае, если рассчитанные коэффициенты Стьюдента для каждой концентрации больше или равны 2,78.