3.2. Эксперимент на Ceriodaphnia affinis Цериодафнии как тест-объект для токсикологических исследований.

Ветвистоусые рачки родов Daphnia и Ceriodaphnia широко распространены в водоемах, поэтому легко доступны для исследования. Они имеют небольшие размеры, не требовательны, высоко плодовиты и имеют короткий цикл развития. Тело их заключено в прозрачную камеру (карапакс), благодаря чему есть возможность на живых экземплярах наблюдать процесс созревания яиц в гонадах, прохождение пищи по пищеварительному тракту, дыхательные движения, ритм сердцебиения. Эти показатели являются весьма важными при постановке токсикологических опытов для оценки степени токсичности и механизма действия веществ [23]. Кроме того, их использование в качестве тест-организмов для биотестирования рекомендовано для государственного экологического контроля [20].

Рачки вида Ceriodaphnia affinisобитают в пресноводных водоемах Европы, Северной Америки, Азии, Северной Африки. Этот вид относится к олиго- и бетамезосапробам и населяет водоемы с замедленным течением (неглубокие озера, реки, водохранилища).

Цериодафнии имеют сравнительно мелкие размеры (половозрелые самки – 1,5 мм, самцы – 0,8 мм), что позволяет в опытах манипулировать с меньшими объемами воды и более компактными емкостями. Биологический цикл развития от рождения до половозрелости у цериодафний короток при оптимальных условиях развития. Так, при температуре 25^oС созревание наступает на 2-3-и сутки от рождения, время первого помета – на 3-4-е сутки, а за срок 7-8 суток у рачков получают 3 помета.

При температуре 18^oС сроки получения трех пометов у рачков могут растянуться до 28 суток. Численность молоди у рачков в первом помете невелика – по 2-6 особей, а начиная со второго помета – от 6 до 20 особей на самку. Этот вид цериодафний моно- или дицикличен. Максимум полового периода размножения приходится на август-сентябрь. В лабораторных условиях самцы появляются при недостаточном освещении, снижении температуры, концентрации растворенного кислорода, голодании.

По отношению к кислородному фактору цериодафния довольно чувствительна, ее нормальное развитие протекает при концентрации растворенного кислорода в воде не ниже 5 мг Ο₂/л. Вследствие этого цериодафнии чувствительны к органическому загрязнению веществами, снижающими концентрацию растворенного кислорода в среде.

Исследуя биологическое действие химических соединений, токсикологи регистрируют изменение выживаемости и плодовитости (основные показатели), длину тела цериодафний, используют биохимические и биофизические показатели; иногда встречаются данные об изменении морфологических признаков.

3.2.1. Методика проведения острого опыта на Ceriodaphnia affinis

В помещении, где содержатся цериодафнии, недопустима обработка химическими веществами с целью уничтожения насекомых, грызунов и др.

Лабораторную культуру Ceriodaphnia affinis ведут на природной воде из водоема либо на водопроводной воде, отстоянной не менее семи суток и желательно дехлорированную путем аэрации. Вода должна удовлетворять следующим требованиям:

1. рН – 7,8-8,2;

2. общая жесткость – 1,3-2,0 мг-экв/л;

3. содержание растворенного кислорода – 5,0-7,0 мг О₂/л.

Рачков лучше всего культивировать в стаканах емкостью 0,5-1 литр, с плотностью посадки не более одной особи на 20 мл объема. При этом удается более объективно оценивать качество культуры, ее пригодность для токсикологических исследований, а также дает возможность вести клональные культуры. С целью адаптации рачков к условиям лаборатории их помещают в смешанную воду: 1 часть среды, в которой рачки жили ранее, и 3 части лабораторной воды. Культуральная среда обновляется полностью один раз в неделю.

В качестве корма для цериодафний используют зеленые протококковые водоросли (Chlorella vulgaris) и пекарские дрожжи. Водоросли вносят в концентрации 250-500 тыс. кл/мл ежедневно (2 мл суспензии на 1 л воды). Дрожжи дают не чаще одного раза в неделю (1-2 мл 1%-ного раствора на 1 л), желательно перед сменой раствора.

Культуру цериодафний выращивают в климатостате, люминостате или бюксе при оптимальных условиях содержания: температуре (25±1)^oС, освещенности 400-600 лк, продолжительности светового дня 10-12 ч.

При культивировании цериодафний удобно содержать рачков двух поколений – материнского (размножающиеся особи) и подрастающей молоди. Продолжительность использования маточных культур ограничивается 15-20 сутками. Отмечается каждое родившееся в лабораторных условиях поколение, и ставится дата рождения.

Для токсикологических исследований используют цериодафний, начиная с третьего поколения. Рачков в возрасте (4±2) ч исследуют на устойчивость к стандартному токсиканту – бихромату калия в остром опыте. Величина LC₅₀ бихромата калия за 24 часа находится в интервале 1,0-2,2 мг/л.

В дальнейшем эксперименты с бихроматом калия ставят одновременно с постановкой основного острого опыта с каждым веществом [54, 55, 57].

Перед основными острыми опытами проводят предварительные опыты для установления диапазона концентраций исследуемых веществ, которые вызывают иммобилизацию или гибель рачков в интервале 10-90 %. В предварительном остром опыте обычно используют по 5 концентраций для каждого вещества, различающихся в 10 раз: 100; 10; 1; 0,1; 0,01 мг/л. Длительность опыта 24 или 48 часов. Из концентраций, используемых в предварительных опытах, отбрасывают концентрации, которые вызывают гибель 0 или 100 % рачков. Оставшийся диапазон концентраций (в котором находится искомая летальная концентрация, вызывающая гибель 50 % рачков) используется для основного острого опыта.

Продолжительность основного острого опыта для данного объекта исследования составляет 48 часов. Основным биологическим показателем служит выживаемость гидробионтов (процент гибели). Острый опыт проводится с набором из пяти концентраций исследуемого вещества, входящих в диапазон, установленный в предварительных испытаниях. Растворы веществ для опытов готовятся с учетом их растворимости.

Для опытов используют химические стаканы объемом 250 мл, куда наливают по 50 мл раствора токсиканта и вносят от 5 до 10 рачков Ceriodaphnia affinis в возрасте (6±2) ч. Для статистической достоверности используют не менее трех повторностей для каждой концентрации. Параллельно ставят контрольные опыты с отстоянной водой и водой с растворителем, использовавшимся для растворения исследуемых веществ в концентрациях, соответствующих разведениям в опытах. Повторность контролей соответствует повторности в опытах. Если в контроле наблюдается значительная гибель организмов, опыт бракуется и должен быть повторен.

Условия проведения опытов те же, что и при разведении культуры цериодафний, но в ходе острых опытов рачков не кормят, а смену раствора проводят ежедневно.

Наблюдения за выживаемостью проводят непрерывно в течение первого часа воздействия раствора, через каждые 15 минут в продолжение второго часа, затем ежечасно до конца первого дня наблюдений, на следующий день – 2-3 раза в сутки[54, 55].