3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

71

Рисунок 10. Кластерный анализ фенотипов, зарегистрированных в 6- и 30-минутном ТНА на большой популяции контрольных зебраданио (n =

200 и 40, соответственно), основанный на способности привыкать у наивной контрольной рыбы (Stewart et al., 2013b). Кластеризация проводилась на основе достоверности отличий (верх) или степени выраженности габитуации (%). Представлено устойчивое привыкание, с

цветовой кодировкой по достоверности различий (р) и степени выраженности (% от контроля) для каждого фенотипа (р = 0.001-0.01 (**-

***), 0,05 (*) или 0.05–0,1 (#), U-критерий Манна-Уитни). Привыкание обозначено увеличением (+) либо уменьшением (-) в течение 6- или 30-

минутного сеанса.

https://t.me/medicina_free

72

Рисунок 11. Кластерный анализ конечных точек, зарегистрированных в

6- и 30-минутных ТОП (n = 80 в группе) у контрольных рыб (Stewart et al., 2013b). На диаграмме показано только поведение, демонстрирующее привыкание, выделенное цветом для обозначения степени привыкания для каждого показателя. Привыкание обозначено увеличением (+) или уменьшением (-) в течение сеанса теста, в цветовой кодировке и с методом кластеризации, как на рис. 10.

https://t.me/medicina_free

73

Анксиогенные манипуляции предсказуемо снижали исследование верхней части ТНА при одновременном повышении замирания, в то время как анксиолитические манипуляции снижали замирание и увеличивали исследование верхней части аквариума (Cachat et al., 2011).

При этом сама способность к привыканию не зависела от анксиолитического либо анксиогенного состояний, поскольку различные показатели в экспериментах выявили высокую чувствительность к тревоге, но низкую степень привыкания, и наоборот (рис. 12).

Также была проведена фармакологическая модуляция габитуома зебраданио при действии анксиолитических (флуоксетин, 100 г/л × 2

недели; этанол, 0,3% × 1 неделя; морфин 1,5 мг/л × 2 недели; и острый никотин, 10 мг/л × 5 мин) и анксиогенных факторов (кофеин, 250 мг/л ×

20 мин; морфин, в течение 3 ч × 2 раза в день × 1 неделя; феромон тревоги в течение 5 мин). В целом, выявлена чувствительность габитуации к действию традиционных анксиолитических и анксиогенных препаратов

(рис. 12), что может быть использовано для применения анализа габитуома при скрининге нейротропных фармацевтических препаратов на зебраданио.

Несмотря на значительную чувствительность к тревоге, некоторые взаимосвязанные параметры поведения (например, переходы вверх и продолжительность или частота и продолжительность неподвижности)

демонстрировали противоположные изменения в рамках одного и того же

(например, анксиогенного или анксиолитического) кластера воздействий

(рис. 10).

Интересно, что габитуация зебраданио в ТНА и ТОП совпадает с некоторыми реакциями грызунов в парадигмах ТОП.

https://t.me/medicina_free

74

Рисунок 12. Габитуом зебраданио, представляющий двухмерный кластерный анализ поведенческих фенотипов по чувствительности габитуации к анксиолитическим и анксиогенным препаратам в 6-

минутном ТНА (n = 200 в группе) (Stewart et al., 2013b). Цвет отражает стандартное отклонение.

https://t.me/medicina_free

75

Например, зебраданио постепенно увеличивали подвижность без значительного изменения пройденного расстояния и без габитуации тигмотаксиса (которое наблюдается у грызунов в ТОП (Champagne et al., 2010, Lamprea et al., 2008, Sousa et al., 2006). Напротив, привыкание к геотаксису у рыб в ТНА напоминает тигмотаксис у грызунов в ТОП.

Такое сходство профилей тревожности и привыкания предполагает, что геотаксис зебраданио в ТНА может быть лучшим показателем реакции зебраданио на новизну, с более высокой конструкционной достоверностью и сходством с тигмотаксисом грызунов (чем рыб).

3.8. Зебраданио как перспективная модель для изучения

сложных заболеваний мозга.

Большинство заболеваний мозга характеризуются сложной гетерогенной клинической картиной, связаны с дефицитом сразу нескольких нейротрансмиттерных систем и имеют полигенную природу

(Kendler et al., 2013, Pantelis et al., 2014). Как отмелось ранее, зебраданио успешно используются в качестве моделей различных нарушений ЦНС,

позволяя как изучать системные механизмы патогенеза данных расстройств, так и тестировать потенциальные фармакологические агенты для их коррекции. Так, например, на личинках и взрослых зебраданио созданы модели нейродегенеративных заболеваний (Wang

индуцированных патологий, например, аддикции, нейротоксидромов и синдрома отмены (Bao et al., 2019).

В таблице 6 приведены основные поведенческие фенотипы,

наблюдаемые при моделировании различных заболеваний мозга на зебраданио. Одним из наиболее широко распространенных расстройств является злоупотреблением нейротропными веществами. Как личинки,

https://t.me/medicina_free

76

так и взрослые зебраданио проявляют высокую чувствительность к различным нейротропным препаратам, часто - с развитием толерантности и синдрома отмены (Stewart et al., 2011c). Многие галлюциногенные препараты (серотонинергические психоделики, глутаматергические диссоциативы и холинергические делирианты), которые мощно воздействуют на ЦНС человека и животных – оказывают эффекты и на зебраданио (Neelkantan et al., 2013a), также обнаруживая сходство между фармакологическими эффектами у зебраданио, людей и грызунов (рис.

13).

Таблица 6. Примеры психических расстройств человека, моделируемые у зебраданио (Kalueff et al., 2014b).

https://t.me/medicina_free

77

корректируются противоэпилептическими средствами.

НейроСнижение двигательной активности, сопровождающееся

характерными биомолекулярными и клеточными маркерами

Дегенерация

нейродегенерации.

чувствительность к снотворным препаратам.

Данные о подобии сравнительной фармакологии различных классов нейротропных препаратов говорят о существенной эволюционной консервативности фармакологических мишеней в ряду позвоночных,

позволяя предсказывать и экстраполировать потентность новых препаратов у других видов (например, человека) по их активности в сравнении с референтными препаратами у зебраданио. Таким образом,

модели зебраданио становятся важным инструментом, который может способствовать трансляционному поиску новых фармацевтических препаратов на основе скрининга на зебраданио (рис. 13).

https://t.me/medicina_free

78

Антиглутаматергические соединения

Логарифмическая шкала активных доз

Серотонинергические соединения

Логарифмическая шкала активных доз

Рисунок 13. Сравнительный анализ эффективных доз различных нейроактивных препаратов (логарифмическая шкала доз) у человека и различных видов животных для антагонистов глутаматных рецепторов,

включая дизоцилпин (MK801), фенциклидин (PCP), ибогаин (Ibo),

кетамин (Ket) и кинуреновую кислоту (KYNA), и отдельных серотонинергических препаратов, включая диэтиламид лизергиновой кислоты, ЛСД (LSD), мескалин (Mes), псилоцибин (Psi) и 3,4-

метилендиоксиметамфетамин (MDMA) (Kalueff et al., 2014b).

https://t.me/medicina_free

79

3.9. Трехмерное фенотипирование взрослых зебраданио для

анализа нейротропных препаратов

В отличие от грызунов и людей, локомоция зебраданио происходит в трехмерных (X, Y, Z) координатах пространства, генерируя сложное поведение и богатые многомерные наборы данных, подходящие для компьютерного извлечения нейрофенотипов (Cachat et al., 2011). В работе разработан первый автоматизированный метод генерации трехмерных траекторий плавания взрослых зебраданио на основе модуля Track3D

программного обеспечения для отслеживания видео EthoVisionXT

(Noldus IT, Вагенинген, Нидерланды). Для анализа трехмерных фенотипов в ТНА тестировались антиглутаматергический препарат фенциклидин (PCP, 3 мг/л), холинергический препарат никотин (10 мг/л)

и серотонинергический галлюциногенный агент диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД, 250 мкг/л), одновременно с помощью двух

2.0-мегапиксельных веб-камер USB (фронтально и сверху). Данная система видеозаписи повышает эффективность высокопроизводительного трехмерного анализа поведенческих реакций зебраданио, и чувствительна к различным классам психотропных препаратов, в т.ч. психостимулянты и галлюциногены (рис. 14).

Рисунок 14. Генерация

трехмерных локомоторных треков у взрослых зебраданио (Stewart et al., 2015d). По часовой стрелке сверху вниз – Контроль,

ЛСД, никотин и фенциклидин.

https://t.me/medicina_free

80

На рисунке 15 продемонстрирована валидность метода Track3D при нейрофенотипировании зебраданио, поскольку он генерирует данные,

сопоставимые (для выбранных конечных точек) с данными, записанными вручную квалифицированными наблюдателями. В частности, выявлена высокая корреляция (с помощью коэффициента Спирмена) между ручным и сгенерированными Track3D показателями в ТНА, на примере действия никотина.

Рисунок 15. Сравнение ручного и компьютерного (Track3D) методов оценки поведения зебраданио в ТНА в контрольной и обработанной никотином (10 мг/л) группах (Stewart et al., 2015d), с использованием парного или непарного U-критерия Манна-Уитни (n = 7-9 в группе).

Корреляция параметров оценивалась по критерию Спирмена (r). NS – нет достоверных различий (Р> 0,05).

В целом, разработанный авторматический трехмерный анализ параметров поведения зебраданио улучшает доступный арсенал нейрофенотипические методы. Помимо получения достоверных,

объективных, количественных и обширных трехмерных фенотипических

https://t.me/medicina_free