3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

31

поведенческих фенотипов (Mueller et al., 2006, Higashijima et al., 2004, Kim et al., 2004, Mueller and Guo, 2009, Delgado and Schmachtenberg, 2008).

Дофамин и норадреналин - ключевые катехоламины мозга, которые играют ведущую роль в регуляции локомоции, обучения, памяти, а также

(особенно дофамин) – в контроле мотивации, пищевого поведения и

(особенно норадреналин) внимания. Дефицит дофамина приводит к развитию биполярной и униполярной (главной) депрессии, шизофрении

(психозов), наркотической зависимости и синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ), а нарушения передачи норадреналина связаны с депрессией, шизофренией и СДВГ. В целом, дофаминергическая

(Boehmler et al., 2004, McLean and Fetcho, 2004, Holzschuh et al., 2001) и

норадренергическая системы (Ma, 1994a, Ma, 1994b), а также их развитие,

у человека и рыб достаточно похожи (Holzschuh et al., 2001, Kaslin and Panula, 2001, Tay et al., 2011, Filippi et al., 2014).

Норадреналин – важнейший мозговой моноамин, участвующий в регуляции бодрствования, памяти и внимания. Его расстройства часто встречаются при различных нейродегенеративных болезнях мозга человека. Норадренергические нейроны у зебраданио находятся в голубом пятне и продолговатом мозге (Ma, 1994a, Ma, 1994b). Геном зебраданио экспрессирует три подтипа альфа-2-адренорецепторов

(adra2a, adra2b и adra2c), общих с млекопитающими, и два типа рецепторов (adra2da и adra2d), которые уникальны для рыб (Ruuskanen et al., 2004). И хотя гомология нуклеотидных последовательностей (около

55%) генов адренорецепторов человека и зебраданио относительно невысока, данные рецепторы обладают похожим профилем фармакологической активности (Ruuskanen et al., 2004), вероятно за счет высокой консервативности биологически значимых лиганд-связывающих

https://t.me/medicina_free

32

участков. Зебраданио чувствительны к ряду адренергических веществ

(Sysoev et al., 2019).

Гистамин – важный моноаминовый нейротрансмиттпер в мозге,

участвует в регуляции когнитивных функций, а также циркадных ритмов и локомоции человека и животных. В целом, гистаминергическая система у зебраданио и других позвоночных достаточно похожа, включая ключевые ферменты синтеза, метаболизма и рецептора гистамина

(Peitsaro et al., 2007). Гистаминергические нейроны впервые отмечают у личинок зебраданио в гипоталамусе и конечном мозге (Eriksson et al., 1998), а у взрослых рыб они находятся в гипоталамусе, также проецируясь на многие другие отделы мозга (Kaslin and Panula, 2001, Sundvik and Panula, 2012).

Серотонин (5-НТ) – еще один важный моноамин мозга, который играет ключевую роль в регуляции эмоций, памяти, настроения и сна человека и животных, и чей дефицит приводит к аффективным

(тревожным, депрессивным) заболеваниям ЦНС, а также и шизофрении,

СДВГ, обсессивно-компульсивным расстройствам и агрессивному поведению (Lucki, 1998). Зебраданио экспрессируют несколько генов рецепторов серотонина (htr1aa, htr1ab, htr1bd и htr2c) (Norton et al., 2008, Schneider et al., 2012), а серотонинергические нейроны взрослых рыб локализуются в ядре шва и проецируются в конечный, промежуточный,

задний и спинной мозг (McLean and Fetcho, 2004, Drapeau et al., 2002, Lillesaar et al., 2009), также встречаясь в эпифизе, заднем бугорке,

гипоталамусе, ретикулярной формации (Lillesaar et al., 2009, Kaslin and Panula, 2001, Rink and Guo, 2004).

Ацетилхолин является нейромедиатором-регулятором памяти,

внимания и сна, нарушения в системе которого у человека отмечаются при шизофрении, болезни Альцгеймера и депрессии. В целом, у рыб и

https://t.me/medicina_free

33

других позвоночных животных холинергическая система эволюционно консервативна, и состоит из мускариновых (Hsieh and Liao, 2002) и

никотиновых рецепторов (Papke et al., 2012, Klee et al., 2012), а также ферментов синтеза (холинацетилтрансферазы, ХАТ) и деградации

(ацетилхолинэстеразы, АХЭ) ацетилхолина. Холинергические нейроны у зебраданио появляются сразу после рождения (Arenzana et al., 2005), в

мозге взрослых рыб широко встречаясь в виде как ХАТ-, так и АХЭ-

реактивных нейронов (Clemente et al., 2004).

1.2. Моделирование заболеваний ЦНС на зебраданио

Стресс традиционно считается основным фактором патогенеза аффективных заболеваний ЦНС, особенно депрессии (Strüber et al., 2014,

Lucassen et al., 2016) и тревожных расстройств (Bystritsky, 2006) – двух наиболее серьезных и чрезвычайно распространенных болезней мозга человека (Kessler et al., 2005, Kessler, 2007, Association, 2013). У взрослых рыб тревожность чаще всего оценивают в ТНА (Приложение 2),

анализируя латентное время выхода в верхнюю часть аквариума и время нахождения наверху (Stewart et al., 2012a). При действии анксиолитических препаратов или манипуляций зебраданио активнее исследуют потенциально более опасную верхнюю зону теста, чем контрольные рыбы (Stewart et al., 2012a). Тест ЧБК, как и ТНА, основан на экспозиции рыб новизне (Kysil et al., 2017; Meshalkina et al., 2017). В

данном акватическом тесте взрослые рыбы зебраданио имеют выбор между исследованием светлой или темной половины аппарата, и обычно проводят больше времени (примерно 60-70%) в ‘защитной’ темной части теста (Приложение 2). Данное поведение (скототаксис) отражает изначальное тревожно-подобное состояние рыб, на которое в эксперименте можно далее воздействовать анксиолитическими или анксиогенными веществами (Kalueff et al., 2013). В частности, при

https://t.me/medicina_free

34

действии анксиолитических веществ зебраданио будут активнее исследовать потенциально более опасный светлый отсек (Калуев и др.,

2022a; Meshalkina et al., 2017).

В ТПК, как отмечалось ранее, оценивается групповое поведение

(стайность) зебраданио, оценивая степень скученности группы рыб

(обычно состоящей из 5-8 особей, Приложение 2) по среднему расстоянию между членами группы, полярности группы, а также по размеру формируемого косяка (Fontana et al., 2018, 2022). Для анализа данных показателей, как показало дисертационное исследование, можно использовать компьютерные программы, позволяющие отследить одновременно все особи косяка в течение одного сеанса (см. далее). При воздействии веществ-анксиолитиков стайность рыб обычно нарушается,

а анксиогенные препараты или стрессорные воздействия вызывают построение более плотного и компактного косяка (Калуев и др., 2022a; Khan et al., 2017; Fontana et al., 2022).

Депрессия - широко распространенное психическое расстройство,

для которого характерны плохое настроение, ангедония, утомляемость,

снижение внимания, асоциальность, суицидальность и гипоактивность

(психомоторная заторможенность), сопровождающиеся нейроэндокринными и нейроиммунными нарушениями (de Abreu et al., 2018, Ma et al., 2017). Большое депрессивное расстройство (БДР)

представляет собой сложное заболевание, которое имеет в своей основе как генетические причины, так и индуцируется факторами окружающей среды (Venzala et al., 2013, Rutter, 2003). У пациентов с БДР нарушен уровень катехоламинов, глутамата и ГАМК в мозге. В терапии БДР наиболее эффективны антидепрессанты СИОЗС, трициклические антидепрессанты и ингибиторы моноаминоксидазы (МАО).

https://t.me/medicina_free

35

Разработаны и валидированы многочисленные модели депрессии на грызунах, основанные на воздействии стрессоров (Fumagalli et al., 2007, Seligman et al., 1975), а также вызванные фармакологически (Barr and Markou, 2005) или генетически (Deussing, 2006). Основными фенотипами в данных моделях являются ангедония, коморбидная тревожность, нарушения сна и нейроэндокринные патологии (Seligman and Beagley, 1975, Porsolt, 2000). Аффективные состояния зебраданио,

подобные депрессии, индуцируются при помощи батареи из нескольких недель ХНС (Fulcher et al., 2017, Marcon et al., 2016, Piato et al., 2011b), см.

примеры в Приложении 3 (Галстян и др., 2022b). Например, ХНС в течение 7–14 дней вызывает у зебраданио общее снижение локомоторной активности, нарушает социальное поведение рыб в стае и измененяет окраску их тела (с яркой на более тусклую) (Gerlai et al., 2000). При этом эффекты ХНС на тревожное и социальное поведение рыб снижаются традиционными антистрессорными препаратами – антидепрессантом СИОЗС флуоксетином и бензодиазепиновым анксиолитиком бромазепамом (Marcon et al., 2016). При этом классический продепрессантный препарат резерпин, который снижает дофаминергическую передачу, наоборот, вызывает у зебраданио нарушение социального поведения, гипоактивность и гиперкортизолемию, напоминая клинические симптомы депрессии

(Nguyen et al., 2014)(Nguyen et al., 2013).

Аддикция (зависимость) – чрезвычайно распространенное расстройство мозга, характеризующееся компульсивным поиском подкрепления несмотря на неблагоприятные последствия (Калуев и др.,

2022a). Феномен наркотической зависимости характеризуется тремя основными признаками: 1) побуждающая мотивация искать и принимать дозу препарата, 2) потеря контроля над принимаемой дозой вследствие

https://t.me/medicina_free

36

возникновения толерантности организма к препарату, и 3) характерная симптоматика в виде отрицательных эмоций, в т.ч. дисфории и тревожности (синдром отмены, когда доступ к препарату ограничен)

(Koob et al., 1998). Мезолимбическая дофаминовая система играет ведущую роль в возникновении и поддержании зависимости у грызунов

ичеловека. Несмотря на анатомические различия в конечном мозге, у

зебраданио наблюдается ключевое сходство в виде гомолога дофаминовой системы (Калуев и др., 2022a), гены и молекулы синтеза и передачи сигналов, а также нейронные пути которой также эволюционно консервативны (Rink and Wullimann, 2002). Как взрослые зебраданио, так

иличинки, могут успешно быть использованы для экспериментального моделирования аддиктивных состояний (Stewart et al., 2011a), в т.ч.

формирование зависимости, толерантности (снижения чувствительности), сенсибилизации (развития гиперчувствительности) к

ним, синдрома отмены (Галстян и др., 2022f), а также других физиологических и поведенческих изменений, возникающих в ответ на действие различных нейротропных веществ (Kalueff et al., 2012).

Зебраданио оказываются чувствительны к самому широкому спектру аддиктивных препаратов (Калуев и др., 2022a). Например, у этих рыб наблюдается дозозависимая реакция на острое действие холинергического психостимулянта никотина: в низких и умеренных концентрациях (до 300 мкМ) он оказывает анксиолитический эффект в ТНА и ТПК, а в высоких концентрациях проявляет анксиогенность (Klee et al., 2011, Levin et al., 2007a). Более того, никотин в малых дозах улучшает выполнение задач, связанных с обучением и память зебраданио,

а в больших дозах, наоборот, ухудшает (Калуев и др., 2022a). В ТНА зебраданио, получающие никотин хронически, увеличивают время,

проведённое на дне аквариума, что соответствует анксиогенному

https://t.me/medicina_free

37

эффекту (Калуев и др., 2022a). Никотиновая зависимость опосредуется гомологичными с млекопитающими генами холинергические никотиновых рецепторов (chrna2a/b, chrna3, chrna5, chraJ, chrnb2 и chrnb4) (Müller et al., 2020).

Другой часто вызывающий у человека зависимость препарат,

этанол, также оказывает дозозависимое действие на поведение зебраданио. В частности, этанол в низких концентрациях (<0.5%)

увеличивает общую локомоторную активность рыб, а также скорость плавания и среднее расстояние между особями в ТПК (Gerlai et al., 2000),

что вскоре сменяется фазой анксиолитического действия препарата

(повышение исследовательской активности в НТТ), а затем, при более длительном воздействии или при введении высоких его концентраций,

препарат начинает оказывать выраженный седативный эффект (Gerlai et al., 2000, Rosemberg et al., 2012, Tran and Gerlai, 2013b, Pannia et al., 2014).

При этом прекращение введения многих из протестированных вызывающих привыкание нейротропных препаратов после их хронического действия вызывает типичные признаки ‘синдрома отмены’ у взрослых рыб зебраданио, в т.ч. выраженное тревожно-подобное поведение и повышение базального уровня кортизола (Cachat et al., 2011).

Таким образом, зебраданио успешно воспроизводят патогенез широкого спектра заболеваний мозга человека, в том числе вызванных различными препаратами, а также могут применяться при скрининге лекарственных средств для их коррекции (Калуев и др., 2022a; Abreu et al., 2022).

1.3. Перспективы скрининга нейротропных молекул на

зебраданио

Зебраданио хорошо подходят в качестве модельного организма для поведенческого и молекулярного анализа эффектов малых молекул (Jones and Norton, 2015, Purushothaman et al., 2015), поскольку они сочетают в

https://t.me/medicina_free

38

себе относительную простоту ЦНС с доступностью последней для экспериментальных манипуляций и существенной сложностью фенотипов для изучения поведенческих ответов на препараты, а также с высокой производительностью доклинического биоскрининга с использованием акватических моделей (Колесникова и др., 2023; Khan et al., 2017; Mezzomo et al., 2017; Abreu et al., 2019b; Wang et al., 2021).

Использование современных систем видеорегистрации поведения позволяет анализировать широкий спектр фенотипов зебраданио,

включая показатели общей активности, направленность движения, ее угловые характеристики, а также особую геометрию паттернов плавания

(меандер, ротации, угловая скорость и др.) (Pérez-Escudero et al., 2014, Conklin et al., 2015). Возможность одновременной регистрации активности нескольких зебраданио в группе также позволяет анализировать социальное и тревожное поведение (Stewart et al., 2014a), а

разработанные на сегодняшний день автоматизированные системы введения препаратов, подачи подкрепления (корма) и компьютерного предъявления стимулов (например, социального подкрепления в виде показа группы рыб, или в аверсивных моделях при экспозиции образа или видео хищника на экране) (Saverino and Gerlai, 2008), все вместе существенно оптимизирует процедуры тестирования. В частности, это позволяет исследовательским коллективам не только адекватно стандартизовать проводимые ими доклинические исследования

(Колесникова и др., 2023), в том числе в кросс-лабораторном контексте,

но и обеспечить эффективный сбор, а также повысить надежность и воспроизводимость полученных эксперименальных результатов (Love et al., 2004, Stewart et al., 2015b).

Как показали ранее исследования нашей лаборатории,

поведенческие параметры зебраданио возможно регистрировать в

https://t.me/medicina_free

39

трехмерном (3D) пространстве (Stewart et al., 2015c). Эта возможность особенно важна с точки зрения тестирования нейротропных препаратов,

так как рыбы (в отличие от человека и грызунов) обладают трехмерной локомоцией (Stewart et al., 2015b), свободно плавая в толще воды по всем трем осям. Таким образом, по сравнению с другими моделями, у

зебраданио появляется дополнительное измерение для экспрессии их поведенческих параметров. Траектории плавания рыб нами ранее было предложено отслеживать двумя камерами, синхронно генерирующими два файла с двухмерными траекториями (Х-Y, Y-Z) для их последующей компьютерной интеграции и получения реальных трехмерных данных,

отражающих траекторию и паттерны движения рыбы (Stewart et al., 2015c, Stewart et al., 2014a). Также было предложено использовать трехмерные данные локомоции рыб по осям X-Y-время – существенная вариация метода, позволяющая характеризовать и визуализировать нейротропные эффекты препаратов в ТНА (Stewart et al., 2015c, Stewart et al., 2014a).

Таким образом, возможность генерации трехмерных данных о локомоции зебраданио существенно повышает этологическую валидность экспериментов (Kalueff et al., 2016), поскольку данные методики учитывают реальный трехмерных характер плавания рыб.

Переход от традиционой двухмерной регистрации нейрофенотипов к более сложной и гранулярной трехмерной также позволяет повысить надежность и воспроизводимость полученных данных, снижая ошибки первого и второго типа (ложные позитивы и негативы, связанные с неизбежным наложением траекторий рыб при традиционной двухмерной регистрации). Данные методики также помогают более корректно выявлять уникальные и более сложные фенотипические профили,

вызванные воздействием специфических фармакологически активных нейротропных средств (Stewart et al., 2015c, Stewart et al., 2014a) –

https://t.me/medicina_free

40

например, отражая характерные признаки отдельных патологических состояний (штопорное движение при эпилепсии, циркулярное плавание при действии диссоциативных галлюциногенов, придонные ‘челночные’ стереотипные движения, описанные ниже для серотонинергических препаратов и т.д.). Сделанный в диссертационной работе следующий шаг

– создание обучающихся платформ для распознавания таких фенотипов на основе ИИ (см. ниже) – логично продолжает данную линию исследования, выгодно используя многомерность нейрофенотипических данных на зебраданио.

При анализе поведения рыб различными программными пакетами чаще всего регистрируют непосредственно траекторию движения точки-

центра тела животного (Kalueff et al., 2016). Тем не менее, имеющиеся в арсенале исследователей сегодня трекинговые программы способны различать и параллельно отслеживать отдельные точки тела рыбы

(например, одновременно регистрируя ее хвост, середину тела и голову/нос), что в дальнейшем может быть применено для выявления и оценки специфических моторных реакций и фенотипов рыб (Kalueff et al., 2013, Stewart et al., 2015b). Например, данный подход особенно удобен в контексте характеризации социального поведения (исследование нос-к-

носу одной особью другой или следование за ней нос-к-хвосту),

агрессивности (кусание оппонента при дуальной конфронтации или собственного отражения в тесте зеркальной агрессии), полового поведения (ухаживание и спаривание), спазмов при эпилепсии (изгибание формы тела под углом в 90о) (Kalueff et al., 2013, Stewart et al., 2015b), см.

также (Zabegalov et al., 2019a; Abreu et al., 2019a) и стереотипий

(Zabegalov et al., 2019b). Использование подобных методов для анализа сложного поведения зебраданио особенно важно при скрининге

https://t.me/medicina_free