3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

121

снижало поведение, подобное отчаянию, у рыб в ТИХ (Demin et al., 2022),

см. дискуссию по модели в (Kositsyn et al., 2022). Анализ полученных данных с помощью ИИ выявил несколько различных кластеров для этих агентов, включая анксиогенные/гиполомоторные (24H-NBF, 24H-

NBOMe и 34H-NBF), поведенчески инертные (34H-NBBr, 34H-NBCl и

34H-NBF). NBOMe), анксиогенные/галлюциногено-подобные (24HNBBr, 24H-NBCl и 24H-NBOMe(F)) и анксиолитические/галлюциногено-

подобные (34H-NBOMe(F)) препараты (рис. 43).

https://t.me/medicina_free

122

ГЛАВА 5. КОНЦЕПЦИЯ СКРИНИНГА С ВЫСОКОЙ ПРОПУСКНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ НА ЗЕБРАДАНИО ДЛЯ ПОИСКА НЕЙРОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VIVO

5.1. Интенсивные и экстенсивные подходы к биоскринингу

Скрининг и создание новых фармакологических препаратов является сложным и трудоемким процессом, обусловливающим тот факт,

что количество потенциальных терапевтических агентов намного превышает количество кандидатов, реально доходящих до стадии клинических испытаний. Например, большинство (40-80%) соединений не проходят стадию доклинических исследований по оценке биодоступности, эффективности и безопасности препаратов (Cook et al., 2014, Waring et al., 2015). Тем не менее чувствительность существующих тестов на грызунах достаточно низкая (<50%), в результате чего возможно большое число ложноотрицательных результатов. В любом случае, поиск новых препаратов часто бывает экстенсивным, требующим скрининг большого количества препаратов-кандидатов in vivo.

Еще один немаловажный вопрос при организации доклинических исследований – это их стоимость, которая значительно увеличивается,

если неэффективность или небезопасность препарата выявляется лишь на более поздних этапах тестирования. Минимизировать фискальную нагрузку в таких случаях возможно путем оптимизации практики ранней фазы доклинических испытаний, в частности, путем активного использования альтернативных животных моделей, например,

зебраданио, которая характеризуется как эволюционно консервативными физиологическими механизмами и молекулярными мишенями (Lowery et al., 2009, Howe et al., 2013a), так и существенной дешевизной исследований (по сравнению с тестированием на грызунах).

https://t.me/medicina_free

123

Стоимость медико-биологических исследований, особенно на человеке, приматах и грызунах, резко возрастает в последние годы.

Проведенный анализ (на примере стоимости в России) позволяет сравнить проведение типичного двухнедельного эксперимента по хроническому введению препарата (например, СИОЗС флуоксетина)

лабораторным крысам и зебраданио (n = 15 в контрольной и опытной группах обоих видов). Анализ проводился с точки зрения 20-30-кратной разницы в стоимости самих животных (800-900 руб за крысу против 25-

50 руб за рыбу), 10-кратной разницы в расходах на содержание на период проведения эксперимента (корм, подстилка и т.д. 7000 руб у крыс против

600 руб за корм рыб), 5-кратной разницы в длительности и стоимости работы персонала по уходу за животными (1-1.5 чел/час в день за крысами против 2 чел/час в неделю за рыбами), 75-кратной разницы в количестве и стоимости самого расходуемого препарата (5 мг/кг веса флуоксетина

Sigma Aldrigh внутрибрюшинно ежедневно 15 крысам весом 500 г

каждая, т.е. всего 525 мг, против 100 мкг/л каждые 3 дня, из расчета 10 л

воды, т.е. всего 7 мг), а также 15-кратной разницы в длительности и стоимости самого введения препарата (3 чел/час в день в течение 14 дней против 10 чел/минут каждые 3 дня, в течение 14 дней). В целом, с учетом данных затрат, суммарная стоимость типового эксперимента с флуоксетином на крысах в ценах на 2023 г. в России составляет порядка

75 000 руб против 8000 руб затрат на проведение аналогичного по дизайну и количеству животных эксперимента на зебраданио, то есть демонстрируя 10-кратную экономию при исследовании на зебраданио.

При этом аналогичный анализ затрат на исследования в ценах США и Великобритании указывает на 100-200-кратное различие в стоимости скрининга нейротропного действия (на примере флуоксетина) на крысах и зебраданио.

https://t.me/medicina_free

124

С учетом данных преимуществ, зебраданио сегодня успешно используются для оценки токсичности препаратов. Помимо экономической выгоды, рассмотреной выше, модель зебраданио хорошо соотносится с концепцией 3R в доклинических исследованиях

(replacement – замена, reduction – сокращение, refinement – уточнение).

Данная концепция предполагает модернизацию доклинических испытаний в сторону замены используемых животных на организмы,

которые находятся эволюционно дальше от человека, чем грызуны, а

также на сокращение количества используемых животных, а также сокращение частоты использования или тяжести процедур, которые необходимо использовать для получения сведений о безопасности и потенциальной эффективности препарата (Tannenbaum and Bennett, 2015).

При планировании биомедицинских экспериментов особо важно правильно оценить необходимый размер выборки n (число объектов в группе). На практике для этого используются статистические онлайн-

калькуляторы, анализирующие статистическую мощность в эксперименте (обычно принимаемую за 0.8), с учетом ожидаемой силы эффекта (сильный эффект 0.5, средний 0.3, слабый 0.1) и уровня значимости (0.05). Важно убедиться, что планируемые когорты достаточно велики, чтобы полученные в ходе опытов результаты имели статистический смысл и могли быть обработаны. Анализ работ нашей лаборатории (Рис. 1-40) показывает, что при скрининге нейротропных препаратов на зебраданио размер выборок обычно составляет 10-15 (реже

15-20) особей в группе, что сопоставимо с обычными размерами выборок при исследованиях на грызунах. Таким образом, на фоне существенной экономии средств и соответствия 3R принципам гуманного биоэкспериментирования за счет проведения доклинических испытаний на рыбах, в нейроповеденческих и нейрофармакологических

https://t.me/medicina_free

125

исследований на них не отмечается особых различий с точки зрения объема выборок по сравнению с традиционными моделями на грызунах,

что несомненно является одним из аргументов в пользу более широкого внедрения зебраданио в доклинические исследования нейротропных препаратов.

Еще раз следует подчеркнуть, что модель зебраданио в полной мере соответствует концепции гуманного биоэкспериментирования.

Например, скрининговые платформы на зебраданио можно использовать как “воронку” для снижения количества тестируемых препаратов, а также в качестве “замены” традиционным тестам на грызунах – более сложных позвоночных животных, чем рыбы. Анализ токсичности на личинках зебраданио позволит на ранних этапах элиминировать из исследований препараты, обладающие выраженным токсическим действием, что в дальнейшем также снизит количество необходимых для тестирования грызунов или взрослых рыб, в итоге снижая общее количество животных,

задействованных в доклинических испытаниях. Наконец, использование эмбрионов зебраданио позволяет уменьшить количество экспериментальных манипуляций с организмом, поскольку благодаря развитию вне организма матери и прозрачности эмбрионов на них можно оценивать токсичность и без дополнительных манипуляций (Cassar et al., 2020).

Благодаря недавнему прогрессу в области медицинской химии,

математического моделирования и биоинформатики, при разработке лекарств стали активно применяться систематические крупномасштабные подходы к биоскринингу фармацевтических веществ

(Bruni et al., 2014). Переход от интенсивного доклинического исследования к более интенсивному скринингу с высокой пропускной способностью при современном поиске лекарств становится возможным

https://t.me/medicina_free

126

благодаря сочетанию быстро растущей вычислительной мощности компьютера с чувствительными инструментами видеозаписи, которые генерируют автоматические фенотипические данные с высоким пространственным и временным разрешением (Cachat et al., 2011, Branson, 2014). Достижения в области автоматического распознавания поведения еще больше облегчают эффективный скрининг нейротропных препаратов in vivo с использованием зебраданио. Например, мониторинг нескольких точек тела зебраданио (например, носа, средней части тела и хвоста) позволяет проводить как автоматизированную количественную оценку передвижения рыбы, так и интерпретацию сложного поведения зебраданио (например, преследование, укусы, социальный подход или снижение общительности), которые параллельны фенотипам человека

(Stewart et al., 2014b).

На рисунке 46 приводится общая стратегия скрининга препаратов на основе алгоритмов машинного обучения и анализа их трехмерных локомоторных путей у зебраданио. На рисунке 47 показаны потенциальные деревья решений (A, B), которые могут использоваться автоматизированными платформами для скрининга нейротропных препаратов in vivo у зебраданио для прогнозирования фармакологических профилей лекарств.

Высокопроизводительный скрининг (ВПС) на зебраданио in vivo

включает экстенсивные (рис. 48) или интенсивные подходы для создания

«больших данных» (big data) в области доклинических исследований. В

настоящее время эти две стратегии могут совместно применяться в исследованиях по скринингу зебраданио, в результате чего платформы с более высокой пропускной способностью способны генерировать

«сверхбольшие данные» (рис. 49).

https://t.me/medicina_free

127

Рисунок 46. Общая стратегия скрининга нейротропных препаратов на основе алгоритмов машинного обучения и анализа трехмерных треков

(Stewart et al., 2015a). Вначале создается референсная библиотека трехмерных поведенческих ответов зебраданио на основные нейротропные препараты всех классов (Stewart et al., 2015b), а затем создаются и проверяются системы ИИ (например, протоколы машинного обучения, MLA) на тестировании известных препаратов со смешанным фармакологическим профилем действия (mixed profiles) или смеси двух нейротропных препаратов (drug mixtures) с известными индивидуальными профилями активности, для дальнейшего предсказания профиля нейротропной активности (drug profile prediction)

и, таким образом, итоговой фармакологической валидации

(pharmacological validation) скрининговой платформы.

https://t.me/medicina_free

128

Рисунок 47. Примеры потенциальных деревьев решений (A, B)

автоматизированных платформ для скрининга нейротропных препаратов in vivo у взрослых зебраданио для прогнозирования фармакологических профилей лекарств (Stewart et al., 2015a).

https://t.me/medicina_free

129

Серотонин

Дофамин

Норадреналин

Ацетилхолин

Глутамат

Гистамин

ГАМК

Рисунок 48. Скрининг фармакологически активных соединений на многочисленных животных в эксперименте на личинках (слева) (Stewart et al., 2015a) и взрослых особях зебраданио. На нижней панели (в рамке)

приведены основные нейромедиаторы зебраданио и картирована их локализация в мозге.

Тем не менее, несмотря на существенные преимущества зебраданио как модельного организма в области трансляционных и доклинических исследований нейротропных препаратов, эти рыбы также имеют ряд существенных концептуальных и практических ограничений. Поэтому знание и понимание данных ограничений (см. ниже) необходимо для успешного, корректного и валидного использования моделей на зебраданио в доклинических исследованиях препаратов.

https://t.me/medicina_free

130

Экстенсивная стратегия Интенсивная стратегия Высокопроизводительный скрининг (ВПС)

Фенотипические профили (баркоды)

Потребность в компьютерной мощности

Рисунок 49. Принципы тестирования большого количества лекарств на большом количестве животных (Stewart et al., 2015a). Повышая эффективность моделей на основе зебраданио для создания новых лекарств для ЦНС, эта стратегия сочетает в себе преимущества экстенсивного подхода (использование большого количества лекарств или протестированных животных) с преимуществами использования обширных исследований (анализ большого количества фенотипов,

которые помогают генерировать механистические гипотезы.

https://t.me/medicina_free