3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

11

Степень научной разработанности темы исследования

В настоящее время стоимость вывода лекарственного средства на рынок составляет миллиарды долларов. Традиционные подходы,

используемые для поиска малых психоактивных молекул на доклинических стадиях, обычно включают биоинформатический анализ in silico, тест-системы in vitro, а также исследования на грызунах. При этом низкая эффективность последних связана с высокой сложностью наблюдаемых фенотипов, высокой стоимостью и этической нагрузкой исследований.

Количество исследований, в которых в качестве модельного объекта используется зебраданио, неуклонно растет (Cassar et al., 2020).

Например, эмбрионы зебраданио используются для скрининга токсичности препаратов как валидированный альтернативный метод оценки острой токсичности (OECD., 1994). Руководство по токсичности лекарственных средств ICHS5 Европейского медицинского агентства указывает, что тестирование in vivo на рыбах, не считаясь подходом по умолчанию, может рассматриваться при особых обстоятельствах (USE, 2015). Нормы содержания и эвтаназии зебраданио прописаны в Европейской директиве по использованию лабораторных животных

(Commission, 2010), однако в России их использование в настоящее время на федеральном уровне не регламентируется (ГОСТ № 32292-2013

испытания химической продукции, опасной для окружающей среды, предусматривает использование эмбрионов и мальков зебраданио для оценки острой и хронической токсичности до 28 дней).

Существует множество тест-систем для оценки параметров ЦНС зебраданио, в т.ч. поведенческие тесты на тревожность, когнитивные (дис)функции, агрессию, социальность рыб и др. (Приложение 2). При изучении тревожности зебраданио традиционно используют тест

https://t.me/medicina_free

12

незнакомого аквариума (ТНА), основанный на геотаксисе (предпочтению рыбы нижней части аквариума), тест черно-белой камеры (ЧБК),

основанный на предпочтении темного отсека (скототаксис) и тест открытого поля (ТОП), основанный на тигмотаксисе (предпочтение периферических зон) (Levin et al., 2007b, Serra et al., 1999, Blaser et al., 2010, Ahmad and Richardson, 2013). Тревожность также можно оценить в тесте построения косяка (ТПК), где оценивается групповое поведение рыб, обычно снижающееся при анксиолитических воздействиях (Engeszer et al., 2007a, Buske and Gerlai, 2012). Воздействие стрессора

(электрический ток, воздействие хищника и др.) уменьшает время,

проведенное в верхней части аквариума в ТНА, в светлой части в ЧБК,

увеличивает плотность стайки зебраданио, что свидетельствует о тревожном фенотипе у рыб (De Abreu et al., 2021; Abreu et al., 2021).

Напротив, антистрессорные препараты (флуоксетин, диазепам)

увеличивают данные параметры, оказывая анксиолитическое действие

(Khan et al., 2017).

Для тестирования когнитивных функций рыб применены крестообразные, Т- и У-образные лабиринты (Приложение 2) и тест условно-рефлекторного избегания места (УРИМ; Галстян и др., 2022g).

Препараты с ноотропным действием, например, пирацетам, улучшают память у зебрадание в данных тестах (Stewart and Kalueff, 2012).

Лабораторией разработан также новый поведенческий тест иммобилизации хвоста (ТИХ) для выявления депрессивно-подобного поведения у зебраданио (Галстян и др., 2022с,h) на основе парадигмы выученной беспомощности при действии неконтролируемого стрессора

(Demin et al., 2020b).

Несмотря на то, что имеется существенная экспериментальная база для исследования нейротропных препаратов на зебраданио, а также

https://t.me/medicina_free

13

генетической и эпигенетической регуляции (Lakstygal et al., 2018; Cheresiz et al., 2020; Yang et al., 2020), их применение для поиска новых нейротропных препаратов в настоящее время существенно ограничено отсутствием понимания степени гомологичности мишеней у рыб и человека, а также отсутствием научно-методической доктрины активного использования зебраданио в нейрофармакологическом скрининге фармацевтических препаратов.

Цель работы

Используя преимущества зебраданио как модельного организма в биомедицине, дать научно-методическое обоснование созданию биоскрининговых платформ на основе зебраданио и их использования в доклинических исследованиях нейротропных фармацевтических препаратов in vivo.

Задачи исследования

1.Исследовать эффекты и оценить возможные механизмы действия отдельных групп нейрофармакологических веществ в экспериментах на зебраданио.

2.Провести тестирование биологически активных фармакологических веществ среди природных соединений и впервые синтезированных соединений на экспериментальных моделях патологических состояний у зебраданио.

3.Исследовать зависимость «структура–активность» отдельных химических веществ и провести скрининг их нейрофармакологических свойств в моделях на зебраданио.

4.Оценить молекулярные биомаркеры острых и хронических эффектов нейротропных препаратов у зебраданио.

5.Разработать и валидировать новые методы скрининга нейротропных эффектов препаратов на зебраданио на основе анализа

https://t.me/medicina_free

14

вибрации, габитуации, изменения окраски кожи, трехмерного нейрофенотипирования и систем искуственного интеллекта (ИИ).

Научная новизна

В работе впервые произведен анализ нейротропной активности широкого спектра препаратов различных классов, в т.ч.

продемонстрирована чувствительность зебраданио к скополамину,

атропину, диэтиламиду лизергиновой кислоты (ЛСД), ареколину,

кавалактонам, фенциклидину, бензодиазепинам, атропину, скополамину и др., и сопоставлены их эффекты с данными на грызунах и человеке.

Проведен комплексный анализ эффективности использования зебраданио для тестирования противоэпилептических препаратов. Предложены новые методы оценки действия нейротропных лекарственных веществ на основе вибрации, генерируемой рыбой во время движения, и изменения окраски кожи зебраданио. Разработан новый автоматизированный метод создания трехмерных траекторий плавания у взрослых зебраданио и автоматического анализа их группового поведения.

Впервые в мире применен искусственный интеллект (ИИ) для анализа результатов тестирования лекарственных веществ на основе вызванных локомоторных паттернов рыб. Впервые проведено исследование по моделированию длительного хронического непредсказуемого стресса (ХНС) у зебраданио с дальнейшей оценкой методов коррекции с применением антидепрессантов и противовоспалительных соединений, что открывает путь к дальнейшей разработке новых фармацевтических агентов на основе модуляторов нейроимунных процессов. Предложена первая экспериментальная модель серотонинового синдрома (СС) на зебраданио. Впервые описаны эффекты новосинтезированных производных фенилэтиламина с

https://t.me/medicina_free

15

модуляцией двигательной активности и тревожно-подобного поведения

зебраданио.

Теоретическая и научно-практическая значимость работы

Теоретическая значимость исследования заключается в расширении представлений о возможностях применения зебраданио в биомедицине для изучения действия фармацевтических препаратов (на примере нейротропных веществ). В работе продемонстрирована чувствительность зебраданио к широкому спектру классических и новых нейротропных препаратов. Показано наличие у зебраданио синдрома отмены для них, впервые описана модель серотонинового синдрома у зебраданио. В работе описаны новые подходы к скринингу лекарственных веществ на зебраданио, в т.ч. модель пролонгированного ХНС на зебраданио для скрининга препаратов с антидепрессантными и анксиолитическими свойствами.

Практической и методологической значимостью работы является использование потенциала зебраданио для скрининга веществ с использованием современных методов компьютерной обработки. В

частности, анализ паттернов локомоции рыб в трехмерном пространстве позволило построить модель с описанием трехмерных траекторий,

отличающаяся более точной оценкой изменения поведения, чем стандартные 2D модели. Использование многомерных данных было впервые применено для обучения ИИ для скрининга веществ,

воздействующих на поведение зебраданио. В работе впервые описывается включение нейросетей в процесс скрининга нейротропных лекарственных веществ на рыбах. На основании полученных данных проведено обоснование доклинических тест-систем с использованием зебраданио для тестирования нейротропных препаратов. Дальнейшая работа в данном направлении позволит использовать данный метод для

https://t.me/medicina_free

16

выявления механизмов действия препаратов, их побочных эффектов и лекарственных взаимодействий в доклинической практике, что поможет существенно снизить затратность и увеличить скорость проведения доклинических исследований новых лекарственных веществ.

Методология и методы исследования

Диссертационная работа проделана на базе Института трансляционной биомедицины СПбГУ, а также (частично) – на базе лаборатории перспективных исследований в области биотехнологии Химико-технологического института УРФУ, научной группы

«Нейробиология» НМИЦ им. В.А. Алмазова МЗ РФ, кафедры фармакологии Медицинской школы Университета Тулейна, США,

Факультета фармацевтики Юго-Западного университета, Китай

(исследования контрольных препаратов в работе), группы доклинического биоскрининга РНЦ РХТ им. акад. А.М. Гранова МЗ РФ и лаборатории молекулярной нейробиологии направления

«Нейробиология» Научно-технологического университета «Сириус».

В основу методологии проведенного исследования легли работы зарубежных и отечественных авторов, посвященные проблемам создания новых биоскрининговых платформ для поиска и тестирования нейротропных препаратов на зебраданио. При проведении исследования и изложения материалов были применены общенаучные методы, метод сравнения, эксперимента. Было произведено сравнение методов оценки поведенческих и биомолекулярных маркеров при действии препаратов на зебраданио с литературными данными, описанными относительно других общепринятых моделей и методик, в том числе клинических данных и данных, полученных с использованием грызунов.

https://t.me/medicina_free

17

Положения, выносимые на защиту

1.Зебраданио является важной моделью для доклинического тестирования препаратов, воздействующих на ЦНС.

2.Модель ХНС у зебраданио является новым перспективным методом для скрининга нейротропных препаратов и выявления механизма их действия.

3.Зебраданио является высокочувствительным организмом к действию противоэпилептических препаратов.

4.Галлюциногенные препараты - ключевые модуляторы ЦНС,

оказывающие выраженные поведенческие фенотипы у зебраданио и нейрохимические реакции, в т.ч. имеющие отношение к моделированию серотонинового синдрома (СС).

5. У зебраданио имеются устойчивые, эволюционно консервативные поведенческие и физиологические эффекты экстракта кавы и кавалактонов, хронические эффекты которых коррелируют с вовлечением нейроглиальных и эпигенетических механизмов.

6. На зебраданио продемонстрирован потенциал анксиолитических эффектов ареколина, чьи механизмы долгосрочного действия на ЦНС могут включать как моноаминергическую, так и нейроиммунную модуляцию.

7. Анализ вибраций и изменения окраски зебраданио являются перспективными методами оценки действия нейротропных лекарственных веществ.

8. Обнаружены сильные нейроактивные свойства новых производных фенилэтиламина, при которых замены в N-бензиловом фрагменте модулируют локомоцию, а в фенетиламиновом фрагменте вызывают тревожно-подобное поведение зебраданио, также влияя на метаболизм серотонина и дофамина в мозге.

https://t.me/medicina_free

18

9. Использование технологий искусственного интеллекта (ИИ), построения габитуома, анализа локомоторных ответов группы (косяка), и трехмерного нейрофенотипирования являются новыми перспективными подходами для скрининга нейротропных лекарственных препаратов на зебраданио.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику работы лаборатории биологической психиатрии Института трансляционной биомедицины СПбГУ, лаборатории перспективных исследований в области биотехнологии Химико-технологического института УРФУ, научной группы «Нейробиология» НМИЦ им. В.А. Алмазова МЗ РФ, группы доклинического биоскрининга РНЦ РХТ им. акад. А.М. Гранова МЗ РФ, лаборатории молекулярной патологии Новосибирского государственного университета, лаборатории трансляционной биопсихиатрии НИИ нейронаук и медицины, лаборатории клеточной и молекулярной биологии и нейробиологии МФТИ, лаборатории молекулярной нейробиологии направления «Нейробиология» Научно-технологического университета «Сириус», а также Национального центра нейронаук COBRAIN Ереванского государственного медицинского университета им. М. Гераци.

Результаты исследования использовались при выполнении государственных заданий: «Моделирование болезней ЦНС с применением зебраданио (Danio rerio)», №121040200141-4 Министерства здравоохранения РФ, «Разработка и оптимизация протокола тестирования токсичности веществ с молекулярной массой более 3 кДа на рыбах (Zebrafish)» № АААА-А18-118042390121-0, разработка новых молекулярно-биологических маркеров патогенеза центральной нервной системы и их коррекции на основе экспериментальных моделей

https://t.me/medicina_free

19

зебраданио (zebrafish) № 121031100292-2, государственных научных грантов: РНФ № 19-15-00053, Новые экспериментальные модели и биомаркеры взаимосвязи стресса и нейровоспалительных процессов»,

2019-2021, РФФИ № 18-34-00996, «Поиск, описание и детальное изучение депрессивного фенотипа у Danio rerio», 2018-2020 гг.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Исследование выполнено в рамках паспорта научной специальности 3.3.6. «Фармакология, клиническая фармакология» по коду ВАК Министерства образования и науки РФ, соответствуя формуле специальности и пунктам 1 (Выявление патогенетически обоснованных фармакологических мишеней), 2 (Разработка и фармакологическая валидация экспериментальных моделей патологических состояний), 4 (Исследование зависимости «структура–активность» в различных классах фармакологических веществ) и 5 (Исследование механизмов действия фармакологических веществ в экспериментах на животных, на изолированных органах и тканях, а также на культурах клеток) области исследований данной специальности. Работа ориентирована на использование фармакологических подходов для решения задач в области фармацевтических наук - создания новых методов и моделей для скрининга лекарственных препаратов и обоснования стратегий поиска новых нейротропных фармацевтических веществ на зебраданио.

Личное участие автора в получении научных результатов.

При выполнении диссертационного исследования автор проявил личное участие в разработке идеи, организации, координации и проведении всех этапов исследования, при формулировании цели и задач, выборе методов исследования, обработке статистического материала и подготовке иллюстраций, анализе и интерпретации полученных данных, получении соответственного финансирования, а также в подготовке

https://t.me/medicina_free

20

публикаций по диссертационной теме. Автором досконально изучена и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, а также самостоятельно сформулированы цели, задачи,

научные результаты и выводы. В целом, личный вклад автора в выполнение диссертационного исследования составляет более 90%.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов исследования обусловлена соблюдением принципов теоретического и экспериментального исследований в биомедицине. Примененные методы исследования соответствуют поставленным целью и задачами работы. Выборка репрезентативна. Размер выборки был рассчитан на основе собственных работ на зебраданио (Abreu et al., 2016, Abreu et al., 2017), а также с использованием онлайн-калькулятора размера выборки

(www.raosoft.com/samplesize.html) для среднего эффекта с погрешностью

5% и уровня достоверности 95%.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 монографии и 112 статей в международной печати в журналах, индексируемых Scopus, Web of Science и РИНЦ, подготовлено 2 учебных пособия (а также тезисы в сборниках материалов конференций), в которых нашли отражение теоретические принципы и результаты работы. Результаты исследований используются в лекционных курсах и семинарах.

Апробация результатов исследования

Основные результаты диссертационного исследования были представлены в виде приглашенных пленарных устных, а также постерных докладов, и обсуждались на 20-28 Международных конференциях по нейробиологии стресса «Стресс и поведение» (ISBS,

Санкт-Петербург, 2008-2021), ежегодных Конгрессах Society for

https://t.me/medicina_free