3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

131

5.2. Ограничения и перспективы зебраданио как модели для

биоскрининга нейротропных препаратов

Как уже указывалось ранее, в человеческом геноме выявлено более

70% кодирующих белок генов, являющихся ортологами генов зебраданио, причем более 90% таких гомологичных генов ассоциированы с различными заболеваниями человека (Kalueff et al., 2014b, Burgess and Burton, 2023, Howe et al., 2013b). Важной отличительной особенностью зебраданио от человека и других млекопитающих является наличие нескольких (чаще 2-х) копий генов, появившихся в результате дополнительного цикла дупликации генома у костных рыб (Glasauer and Neuhauss, 2014). Так, около 20-25% человеческих генов гомологичны двум и более родственным паралогам зебраданио (Sato et al., 2009, Hoffman et al., 2016). На сегодня лишь некоторые из таких генов изучены и функционально охарактеризованы, и поэтому непонимание многих из таких дуплицированных генов-ортологов осложняет использовании зебраданио в трансляционной нейробиологии и нейрогенетике.

Кроме того, для моделирования генетически-обусловленных расстройств с потерей функции гена является необходимым инактивировать оба паралога у зебраданио (Schmid et al., 2013).

Например, только мутации, нарушающие работу обоих ортологов гена

TDP-43, ответственного за развитие амиотрофического склероза,

приводят к появлению у зебраданио фенотипа мышечной дегенерации

(Burgess and Burton, 2023, Schmid et al., 2013). Вместе с тем, наличие дублированных копий одного гена может явиться и большим преимуществом зебраданио как модели для нейробиологических исследований. Так, в отличие от млекопитающих, где отсутствие одной копии витального гена может привести к смерти, у зебраданио возможны жизнеспособные нокауты таких генов по одной из копий, что позволяет

https://t.me/medicina_free

132

изучать их функции и разрабатывать новые методы лечения различных заболеваний (de Abreu et al., 2020a). Более того, наличие двух копий конкретного гена при создании нокаутных моделей на зебраданио позволяет вместо классического распределения генотипов: +/+ (дикий тип), +/- (мутанты-гетерозиготы) и -/- (гомозиготные мутанты), иметь гораздо более гранулярную картину генотипов +/++/+, +/++/-, +/+-/-, +/- +/-, +/--/-, -/--/- и т.д. Это не только позволяет более полно изучить ген-

дозозависимые эффекты при генетических модификациях на зебраданио,

но и широко использовать данный арсенал линий в фармакогенетических исследованиях.

С другой стороны, многие из ограничений зебраданио как модели носят технический и/или методологический характер, а часто обусловлены текущим уровнем развития технологий, что вполне может быть преодолено в будущем, по мере увеличения производительности,

мощности и разрешительных способностей биоскрининговых платформ.

Например, наиболее часто на зебраданио применяется введение фармацевтических агентов при помощи водной иммерсии, где препарат проникает в системный кровоток рыб через жабры, богатые кровеносными сосудами. С одной стороны, это требует использования либо водорастворимых препаратов, либо дополнительного разведения в растворителе, например, диметилсульфоксиде (ДМСО) в поведенчески-

инертной концентрации 0.1%. С другой стороны, проникнув в кровоток через жабры (и также частично всосавшись через кожу), препарат может оказывать быстрое действие на показатели ЦНС, по сути напоминая внутривенное введение. Так, действительно, этанол, кетамин, никотин и ЛСД начинают оказывать свое действие на поведение зебраданио практически уже сразу к первой минуте после введения. Тем не менее, для получения более выраженных эффектов нейротропных препаратов, при

https://t.me/medicina_free

133

их остром введении обычно используют 20-минутную экспозицию,

которая, как показывают представленные выше данные диссертационной работы, также оказывается оптимальной методически и достаточной для достижения необходимых концентраций препарата в органе-мишени

(мозге), для индукции им нейроэндокринных ответов (выделение кортизола), а также для инициации экспрессии маркерных генов в мозге

(например, ранних протоонкогенов c-fos, c-jun и egr1, отражающих возбуждение нейронов ЦНС).

При остром и особенно хроническом введении препаратов необходимо учитывать физико-химические особенности растворов. В

частности, некоторые вещества представляют собой ирританты. К

примеру, часто используемый на зебраданио анестетик и седативное средство трикаин обладает слабокислой реакцией, и за счет этого сам по себе может раздражать кожу и глаза рыб даже при остром введении.

Поэтому такие препараты важно вводить с буфером, поддерживая pH

раствора близким к нейтральным значениям.

При хроническом введении методом иммерсии важно также учитывать стойкость препарата – например, его возможный водный или световой гидролиз. К примеру, антидепрессант флуоксетин имеет ~30%

водный гидролиз, и поэтому его раствор необходимо обновлять каждые

2-3 дня. Алкоголь у рыб вызывает повышенное образование слизи, и

поэтому его раствор также необходимо периодически заменять в опытах с хроническим введением (при этом сама процедура замены раствора должна быть максимально бытрой, чтобы избежать появления у рыб синдрома отмены). Также следует учитывать возможность быстрого развития привыкания (толерантности) к ряду аддиктивных препаратов,

например, алкоголю или бензодиазепинам. Поэтому данные препараты необходимо вводить с градуальным повышением дозы, например,

https://t.me/medicina_free

134

увеличивая на 5% ежедневно. Водостойкие препараты можно просто добавлять в уже имеющийся раствор, в котором плавают зебраданио в домашнем аквариуме.

Подбор дозировок – еще одна потенциальная проблема в доклинических исследованиях на зебраданио. Ряд препаратов, например,

ГАМК-ергических, у грызунов и человека обладает выраженным анксиолитическим (в малых дозах) и седативным (в высоких дозах)

эффектами. Обычно проявление данных эффектов достаточно разнесено по шкале доз, и экспериментатор на практике может легко подобрать нужную дозу для достижения желаемого эффекта. У зебраданио, однако

(вероятно в силу широкой представленности эволюционно древней ГАМК-ергической системы в ЦНС), анксиолитические дозы для бензодиазепинов следуют почти сразу перед седативными, и поэтому подобрать нужную дозу ряда препаратов в таких моделях практически может быть достаточно сложно.

Помимо водной иммерсии, существует целый ряд альтернативных способов острого и хронического введения препаратов рыбам-

зебраданио, например, пероральное (Kulkarni et al., 2014),

внутрижелудочковое (Nery et al., 2014), внутрибрюшинное, подкожное,

внутримышечное и внутривенное введение (Parker et al., 2012), которые также позволяют методически решить проблемы введения препаратов и их дозировки. Как уже указывалось, целесообразно параллельно проводить анализ содержания препаратов в тканях и органах-мишенях

(особенно при наличии выраженных поведенческих и физиологических ответов), например, используя метод масс-спектрометрии, который позволяет доказать, что тестируемые вещества способны достичь таргетных тканей и оказать свое нейрофармакологическое действие.

Наконец, следует учитывать, что фармакокинетика фармацевтических

https://t.me/medicina_free

135

соединений может отличаться у зебраданио по сравнению с человеком и грызунами (Fernandes et al., 2014), особенно с учетом холоднокровности рыб и теплокровности млекопитающих, таким образом требуя дополнительных фармакокинетических исследований на максимально широком спектре экспериментальных моделей, включая зебраданио.

Благодаря многочисленным преимуществам слизистой оболочки носа как мишени для доставки лекарственных средств, широкий спектр лекарственных средств, в том числе влияющих на ЦНС, человеку и животным можно вводить интраназально (Pires et al., 2009). У зебраданио хорошо развита обонятельная система, которую рыбы активно используют для обнаружения пищи, хищников и потенциальных партнеров, аналогично другим позвоночным (Braubach et al., 2009, CalvoOchoa and Byrd-Jacobs, 2019). Пилотными исследованиями нашей лаборатории недавно было показано, что закапывание с помощью микропипетки 1 мкл раствора ареколина в разных дозировках (1-15

мг/мл) в ноздри рыбам, зафиксированным в губке на несколько минут,

вызывает выраженное поведенческое действие при их последующем тестировании в ТНА (Галстян и др., 2023). В целом, высокие дозы ареколина вызывают у рыб выраженное анксиолитико-подобное поведение, приводя к увеличению длительности и снижению частоты пребывания в верхней части аквариума. Эти эффекты, в целом,

напоминают аналогичные ответы на системное введение ареколина взрослым зебраданио с использованием обычного метода - 20-минутной иммерсии – в стандартных концентрациях препарата (мг/л), на несколько порядков превышающих интраназально вводимые концентрации

(Serikuly et al., 2021).

Таким образом, используя подобные новые методы введения лекарств на рыбах, для достижения ожидаемого эффекта можно не только

https://t.me/medicina_free

136

в несколько раз сократить продолжительность острого эксперимента, но и почти в тысячу раз минимизировать использование лекарств. Последнее может иметь важное практическое значение для доклинических исследований, например, в случаях, если доступны лишь небольшие количества новосинтезированных веществ, либо когда в исследованиях применяются чрезвычайно дорогостоящие вещества.

С учетом различия путей введения веществ в организм грызунов и зебраданио, необходимо еще раз затронуть проблему подбора доз экспериментальных препаратов. Данный вопрос возникает каждый раз,

когда на рыбах либо тестируется совершенно новый препарат

(неизвестного профиля и диапазона активных доз), либо когда тестируется известный препарат с известным диапазоном доз на грызунах или человеке, но ранее не дававшийся зебраданио. Как правильно подобрать начальную дозу, от которой потом можно отталкиваться в дальнейших исследованиях на зебраданио? С одной стороны, возможна прямая конвертация системных дозировок с грызунов на рыб (условно, 1

мг/кг внутрибрюшинно = 1 мг/л при введении иммерсией), которая в качестве пилотных исследований, по нашему опыту, работает для многих препаратов. Однако, поскольку при введении вещества путем водной иммерсии зебраданио находится в растворе постоянно, часто целесообразно снижать концентрацию исследуемого соединения во избежание развития токсических эффектов у рыб.

С другой стороны, при подборе доз целесообразно учитывать данные о других известных химических аналогах исследуемых соединений, их растворимости и (при наличии) таргетных взаимодействиях с рецепторами и белками. Например, отмеченная выше

(рис. 13) гомология рецепторов и других элементов моноаминергических и глутаматергических систем между рыбами и млекопитающими

https://t.me/medicina_free

137

позволяет предполагать аналогичные эффекты близких по профилю нейрофармакологической активности соединений, а наличие баз данных или библиотек нейрофенотипов зебраданио (или других видов) может существенно облегчить подбор концентраций новых веществ-аналогов уже известных ‘референтных’ препаратов, поскольку он будет обоснован на экстраполяции на основании знания относительных потенций связывания препаратов в сравнении друг с другом. Наконец, при анализе действия нейротропных препаратов на ЦНС зебраданио также существуют проблемы с оценкой количества попавшего препарата в организм и особенно в мозг, в силу чего необходимо учитывать особенности проницаемости гематоэнцефалического барьера у рыб

(который у них похож в целом, но несколько более проницаем, чем у грызунов), а также важно провести первичную оценку липофильности вводимых иммерсией малых молекул для их всасывания из воды жабрами

(и, в меньшей степени, кожей).

Как модель для доклинического биоскрининга, зебраданио также обладают некоторыми дополнительными объективными ограничениями,

по сравнению с другими лабораторными животными, например, мышами.

Например, существуют десятки генетически гомогенных (инбредных)

линий мышей, которые удобны для проведения генетических манипуляций для получения мутантных или трансгенных животных.

Такие линии мышей не только хорошо охарактеризованы генетически, но и подробно изучены фенотипически, в т.ч. с точки зрения их поведенческих, нейрохимических и нейроморфологичеких особенностей.

Для зебраданио выведение инбредных линий происходило гораздо меньшее время исторически, и также осложнено генетическим дрифтом у рыб, в силу чего существует лишь несколько условно-инбредных линий зебраданио.

https://t.me/medicina_free

138

С другой стороны, возникает концептуальный вопрос о том,

насколько вообще необходимо сужать биомедицинские исследования,

преференционно сводя их к инбредным линиям модельных объектов?

Один из аргументов заключается в том, что применение инбредных линий позволяют минимизировать индивидуальную вариабельность ответов,

тем самым 1) повышая воспроизводимость результатов (а, следовательно,

и саму валидность) исследований, а также 2) позволяя более четко вычленить и оценить изменения исследуемых биологических параметров как таковых (за счет снижения вариабельного “шума”) в ответ на конкретное экспериментальное вмешательнство (например, мутацию отдельного мозгового гена). Однако такие исследования будут иметь небольшую популяционную валидность, поскольку в них использованы искусственные популяции, лишенные естественной вариабельности. С

учетом важности данных факторов в персонализованной медицине, в

настоящем исследовании использовались аутбредные зебраданио дикого типа, генетическая неоднородность и фенотипическая вариабельность которых максимально приближена к чрезвычайно неоднородной человеческой популяции, тем самым позволяя лучше изучить индивидуальные реакций, чем при использовании генетически гомогенных линий рыб. Существование выраженных линейных различий в поведении зебраданио также является аргументом в пользу использования в доклинических исследованиях как инбредных, так и аутбредных линий, поскольку эффекты препаратов на ЦНС тоже могут зависеть от линий лабораторных животных, и предпочтение одной для тестирования из них может исказить данные и, следовательно,

интерпретацию профиля действия препарата на зебраданио.

Стимулы и факторы окружающей среды имеют решающее значение в доклинических исследованиях, а обогащение среды

https://t.me/medicina_free

139

способствует нейропротекции, нейромодуляции, нейрогенезу (Abreu et al., 2020), и позитивно влияет на патологическое поведение животных,

сформировавшееся вследствие стресса или приёма психоактивных веществ (Van Praag et al., 2000). Обогащение среды также модулирует экспрессию ряда ключевых мозговых генов, связанных с синаптической пластичностью, нейрональной передачей сигналов, обучением и памятью

(Rampon et al., 2000). Зебраданио – важный организм в трансляционной медицине (Kalueff et al., 2014a) для изучения роли обогащения среды

(Volgin et al., 2018; Barcellos et al., 2018; Marchetto et al., 2021), которая способствует увеличению размера их мозга (DePasquale et al., 2016),

пролиферации теленцефальных клеток (von Krogh et al., 2010),

повышению нейротрофического фактора мозга (BNDF) и снижению экспрессии провоспалительных цитокинов интерлейкинов IL-1β и INF-γ (Barcellos et al., 2018). Личинки зебраданио, выращенные в обогащенной среде, демонстрируют лучшую выживаемость по сравнению с личинками, выращенными в обычных лабораторных аквариумах.

Обогащение среды приводит к другим положительным эффектам у зебраданио, снижая уровень кортизола и тревожность (Marcon et al., 2018). Например, пребывание в обогащенных аквариумных условиях в течение 3-4 недель снижает тревожное поведение, вызванное непредсказуемым хроническим стрессом, уменьшает опосредованную стрессом гиперсекрецию кортизола, что проявляется в увеличении исследовательского поведения и пассивной реакции избегания у взрослых зебраданио (Spence et al., 2011). В тоже время, тревожность часто наблюдается у животных, содержащихся социально изолированно,

в структурно бедной среде или подверженных ХНС (Collymore et al., 2015, Marcon et al., 2018). В тестах, основанных на стрессе новизной (ТНА, ЧБК и ТОП), обогащение среды снижает тревожность зебраданио (Barcellos et

https://t.me/medicina_free

140

al., 2018), что проявляется в увеличении исследовательского поведения,

снижении фризинга, эрратических движений, тигмотаксиса в ТНА,

скототаксиса в ЧБК и геотаксиса в ТОП (Buenhombre et al., 2021). При этом обогащение среды зебраданио также может влиять на фармакодинамику тестируемого препарата, например, выявляя синергизм ОСО и анксиолитических препаратов (диазепам, флуоксетин) как у изолированных особей, так и у целого косяка (Giacomini et al., 2016). В

целом, стимулы окружающей среды зебраданио способны модулировать их ответы в доклинических испытаниях, и должны приниматься во внимание для получения достоверных и репродуцибельных данных

(Калуев и др., 2022a; Khan et al., 2017; Mezzomo et al., 2017; Lieggi et al., 2019).

В доклинических исследованиях одной из проблем является чувствительность животных к средовым факторам, связанным с условиями проведения самих экспериментаторов (De Abreu and Kalueff, 2021). Например, известно, что лабораторные грызуны по-разному реагируют на мужчин и женщин-лаборантов, испытывая меньшую тревогу от последних. Порядок тестирования (т.н. эффект батареи) при использовании нескольких тестов поочередно также влияет на эффективность тестирования нейротропных препаратов на грызунах.

Освещение, запахи, шум, вибрация, цвет стен и любые иные факторы в лаборатории могут повлиять на результаты тестирования. Поэтому понимание роли данных факторов необходимо для построения эффективных биоскрининговых платформ на зебраданио (Kysil et al., 2017). Наши систематические исследования показали (Калуев и др.,

2022a; Lieggi et al., 2019), что зебраданио оказываются чувствительны к уровню вибрации в лаборатории, например, исходящей от насосов акватических систем (чем ближе аквариум к насосу, тем выше вибрация

https://t.me/medicina_free