3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

211

движениям-метаниям (erratic movements), тогда как анксиолитические препараты и стимулы увеличивают время пребывания наверху ТНА

(Levin et al., 2007b, Bencan et al., 2009a, Stewart et al., 2011d, Piato et al., 2011a, Kysil et al., 2017).

Основные параметры, анализируемые в тесте, и процедура тестирования (Калуев и др., 2022; Kysil et al., 2017; Giacomini et al., 2021):

Частота заплыва и продолжительность нахождения в верхней части аквариума. Более длительное пребывание в верхней части аквариума указывает на более низкий уровень тревожности.

Латентный период (латентность) выхода наверх. Попав в новую среду обитания, зебраданио естественным образом ныряют на дно аквариума, и лишь спустя какое-то время постепенно исследуют его по мере привыкания к тесту. Повышение латентности выхода наверх указывает на более высокий уровень тревоги.

Пройденная дистанция. Отражает общие моторные и неврологические фенотипы. Как правило, у стрессированной рыбы снижена исследовательская активность за счет увеличения времени замирания, и поэтому пройденная дистанция может быть ниже. Однако дистанцию необходимо рассматривать в комплексе вместе с другими параметрами. Например, если зебраданио проплыла большую дистанцию,

но при этом находилась в нижней части аквариума, то вывод о высоком уровне тревожности следует считать достоверным.

Средняя скорость. Локомоторный параметр зебраданио. Как правило, положительно коррелирует с показателем пройденной дистанции.

Частота и продолжительность фризинга и эрратических движений.

Указывает на повышенное беспокойство/тревожность и, как правило,

выше у зебраданио, находящихся в состоянии стресса.

https://t.me/medicina_free

212

Общая мобильность. Также, в ТНА можно выявить (с

использованием специальных программ, позволяющих задать необходимые параметры) характер подвижности: высокая или низкая подвижность (например, в % от общей активности), что может дополнить сведения об активности рыб. Помимо основных поведенческих параметров ТНА, существует ряд специфических маркеров в зависимости от типа воздействия или вводимого препарата: характер судорожных припадков, уровень токсичности лекарственных веществ, как правило,

вызывающей у рыб атаксию (нарушение координации движений) и

другие (Калуев и др., 2022).

2. Тест черно-белой камеры (ЧБК)

Тест черно-белой камеры (ЧБК) традиционно использовали для количественной оценки тревожного поведения у животных. Аналогично ТНА и ТОП, тест ЧБК основан на погружении рыб в новые, незнакомые условия с последующей характеристикой поведенческих особенностей

(Калуев и др., 2022; Song et al., 2016; Kysil et al., 2017). Для зебраданио тест ЧБК впервые был предложен в 1999 году,

продемонстрировав, что рыбы предпочитают больше времени проводить в темной части аквариума (скототаксис)

(Serra et al., 1999). Показано, что скототаксис помогает рыбам избегать хищников в природе, поскольку взрослые зебраданио четко выделяются при плавании на светлом фоне, что способствует увеличению уровня тревожности, возникающей при нахождении на белом фоне (Blaser et al., 2010). Помимо этого, было продемонстрировано, что препараты,

https://t.me/medicina_free

213

обладающие анксиогенными свойствами, увеличивают частоту и продолжительность заплывов в темную часть аквариума. Также необходимо обратить внимание на то, что предпочтение рыб светлой или темной половине тестовой установки зависит от уровня внешнего освещения. При сильном освещении или при большей концентрации света в белом отсеке, зебраданио предпочитают находиться в темном отсеке (Stephenson et al., 2011, Steenbergen et al., 2011).

Основные параметры, анализируемые в тесте, и процедура тестирования (Калуев и др., 2022):

Частота заплывов и продолжительность пребывания в светлом отсеке. Более длительное пребывание в светлой части ЧБК указывает на более низкий уровень тревожности.

Латентный период заплыва в светлую часть аквариума. Попав в новую среду обитания, зебраданио естественным образом не заплывают в светлую часть аквариума и постепенно исследуют её по мере привыкания к установке. Более длительная задержка указывает на более высокий уровень беспокойства.

Частота и продолжительность фризинга и эрратических движений в светлом отсеке. Указывает на повышенное беспокойство/тревожность и,

как правило, выше у зебраданио, находящихся в стрессовом состоянии.

Перед началом работы рыбы должны пройти процесс акклиматизации в новом помещении (не менее 30 мин), в котором будет производиться съёмка. Для острого эксперимента (перед ЧБК) каждая рыба подвергается воздействию лекарства (Калуев и др., 2022; Song et al., 2016).

3. Тест построения косяка (ТПК)

Тест построения косяка (ТПК, shoaling test) является поведенческим тестом, активно применяемый с целью оценки тревожного состояния рыб

(Калуев и др., 2022). У зебраданио, как у социальных водных животных,

https://t.me/medicina_free

214

выработалось эволюционно консервативное и жизненно важное поведение – способность к построению косяка (shoaling) (Ward et al., 2008, Reyhanian et al., 2011), которое поддерживается на относительно стабильном и высоком уровне на протяжении всей жизни (Miller and Gerlai, 2007). Косяк — это группа рыб, тесно взаимодействующих друг с другом с целью облегчения поиска пищи и увеличения собственной безопасности (больший косяк с высокой долей вероятности обнаружит приближающегося хищника или обнаружит его раньше, чем отдельная рыба) (Miller and Gerlai, 2007). Показано, что плотность косяка

коррелирует с присутствием хищников, а организация косяка в период развития связана с активностью дофаминергических нейронов

(Engeszer et al., 2007a, Buske and Gerlai, 2012).

Основные параметры,

анализируемые в тесте (Калуев и др.,

2022): Среднее расстояние между рыбами. Показано, что меньшее расстояние между рыбами (формирование более плотных косяков)

является признаком тревожности и беспокойства у рыб. Дополнительно

(особенно с применением современных методов регистрации группового поведения) можно оценивать размер косяка, среднее расстояние до максимально отдаленной рыбы, % времени нахождения всех рыб косяка вблизи (например, на расстоянии 2.5 см – одной дины тела).

Процедура тестирования: Перед началом работы рыбы должны пройти процесс акклиматизации в помещении (не менее 30 мин), где будет осуществляться видеосъёмка. Данный эксперимент выполняется в аквариуме, аналогичному аппарату ТНА (см. выше), в который

https://t.me/medicina_free

215

помещаются 4-6 рыб после предварительной экспозиции в растворе с лекарством. После 5-минутной акклиматизации в тестовом аквариуме,

необходимой для нормализации группового поведения, осуществляется фотосъёмка косяка зебраданио после установленных равных промежутков времени (после каждых 5-10 с в течении 1-5 мин, после каждой минуты в течение 10 мин). Каждую фотографию необходимо откалибровать по размеру аквариума и измерить расстояния (в см) между каждой рыбой в группе (Volgin et al., 2019b). При анализе можно также использовать современные методы видео-регистрации группового поведения рыб (Калуев и др., 2022).

4. Тест социального предпочтения (взаимодействия)

Взаимодействие между особями одного вида является главной составляющей социального поведения и фактором нормального развития индивида в сообществе. Нарушения взаимодействия с окружающими и социальная изоляция могут быть следствием многих психических расстройств (HOUSE et al., 1970). В трансляционной диагностике расстройств ЦНС у животных используется тест

социального взаимодействия (social interaction test), результат которого отражает фенотипические проявления патогенеза, базирующийся на реципрокном изменении поведения зебраданио вследствие присутствия и действий других сородичей (фото). Могут использоваться различные модификации теста, различающиеся по количеству предъявляемых стимулов и их качеству (Engeszer et al., 2004). Изначально, этот тест широко использовался для грызунов, однако позднее был адаптирован и для водных позвоночных (Калуев и др., 2022; Галстян и др., 2022d).

https://t.me/medicina_free

216

Данный тест чувствителен к нарушениям социального поведения и часто используется для оценки животных в моделях аутизма и шизофрении (Семёнова et al., 2020)(Stewart et al., 2014b). У зебраданио, к 14 дню мальки уже способны формировать плотные косяки. К 21 дню социальные взаимодействия обусловлены социальными сигналами,

которые особи посылают друг другу с помощью характерных паттернов плавания. К 30 дню после вылупления зебраданио полностью формирует комплекс социальных паттернов, необходимых для установления контакта с сородичами (Stednitz, 2019). Предполагается, что рыбы взаимодействуют с сородичами, ориентируя к ним ось своего тела.

Основные параметры, анализируемые в тесте, и процедура тестирования (Калуев и др., 2022, 2023a,b)

Тестовая установка для зебраданио представляет собой прозрачный пластиковый контейнер, разделенный перегородками на 3 зоны:

центральная зона, содержащая тестируемое животное, один пустой отсек,

и один отсек, содержащий незнакомую рыбу. Перегородки между зонами могут быть как непроницаемы (в этом случае тестируемое животное получает только визуальный стимул), или иметь отверстия,

обеспечивающие дополнительные ольфакторные стимулы, важные для вызова социальных реакций у зебраданио (Stewart et al., 2014c). В

некоторых модификациях данного теста используются камеры с двумя отсеками и перегородкой, которая может менять свою проницаемость и позволять рыбам видеть сородича во время тестовой сессии, но не во время адаптационного периода (Stednitz et al., 2018).

В тесте социального взаимодействия для зебраданио оцениваются следующие параметры: общая пройденная дистанция экспериментального животного, расстояние до перегородки, % времени взаимодействия (отношение времени, проведенном возле перегородки к

https://t.me/medicina_free

217

общему времени теста), время, проведенное возле перегородки (зона 5-6

см) и число заходов в зону возле перегородки. Также, при автоматизированной обработке, анализ траекторий движения опытной и тестовой рыбы (тестера) необходим для выявления четких фенотипов социальных взаимодействий. Тестирование обычно проводят в два этапа: 1) акклимация в течение 10 мин, когда тестовому животному позволяют исследовать аквариум, без предъявления стимула; 2) Тестирование в течение 10 мин, когда тестовому животному предъявляют сородича или его изображение и фиксируют его поведение (Калуев и др., 2022).

5. У-образный лабиринт

У-образный лабиринт (Y-maze, фото) – еще один широко применяемый метод оценки пространственной памяти и обучения как у грызунов, так и зебраданио. Ранее было разработано множество тестов для оценки способности зебраданио к адаптивному обучению, таких как тест «активное избегание», Т-образный и крестообразный лабиринты, и

др. К основным недостаткам данных методов можно отнести временные затраты на обучение животных в этих тестах, а также подстраивание протоколов для каждого отдельного функционального анализа адаптивного поведения под определенные задачи, что является трудоемким процессом. В связи с этим возникла необходимость разработки быстрого и точного теста для оценки адаптивного поведения,

каким является У-образный лабиринт (Калуев и др., 2022).

В основе данного теста лежит принцип спонтанного выбора

(spontaneous alternation). Поведение спонтанного выбора (ПСВ)

описывает тенденцию животных менять направление своего поворота в серии последовательных поворотов (Lalonde, 2002). Каждый выбор статистически зависит от предыдущего, что свидетельствует о его

https://t.me/medicina_free

218

мнестическом происхождении (Estes and Schoeffler, 1955, Solomon, 1948, Walker, 1958).

В отличии от других типов мнестических задач, тестирование в У-

образном лабиринте не требует предварительного обучения или подкрепления, поскольку оценивается свободный выбор животного

(Галстян и др., 2022).

Классическая тестовая установка состоит из трех одинаковых рукавов,

расположенных под углом 120

градусов относительно друг друга

(высота 10 см, длина 15 см,

ширина 7 см; 5 см длина, 2 см ширина), полностью заполненных водой (Aoki et al., 2015). Размеры установки также могут меняться.

Температура и химический состав воды в лабиринте должны быть аналогичными аквариуму домашнего содержания (Калуев и др., 2022).

Процедура тестирования включает в себя три этапа:

Этап 1. Акклимация. Для снижения эффекта новизны каждую рыбу помещают в лабиринт, закрытый прозрачной крышкой для предотвращения выпрыгивания из установки, на 10 мин.

Этап 2. Тестирование. На данном этапе отмечается стартовый рукав,

в котором находится рыба на начало эксперимента. Важно: для каждого животного стартовый рукав выбирается произвольно. Далее подсчитывается количество и последовательность поворотов в течение не менее 1 часа или до 100 входов в рукав. Если рыба выполнила 100 полных входов в рукава до окончания назначенного времени, тест заканчивают раньше. По окончанию тестирования рыбу аккуратно вылавливают

https://t.me/medicina_free

219

сачком и помещают в другой аквариум для дальнейших манипуляций либо в домашний аквариум.

Этап 3. Анализ данных. Анализ данных и построение тетраграмм производится по принципу анализа левых (Л) и правых (П) поворотов при выходе из рукава. Тетраграммы (ПППП или ЛЛЛЛ) представляют собой чистые повторения поворотов в одну сторону, а тетраграммы (ПЛПЛ и ЛПЛП) - чистые чередования. Стратегия полностью случайного поиска состояла бы в том, чтобы выбрать каждую потенциальную тетраграмму одинаково (Галстян и др., 2022g). Однако последовательности ответов могут включать в себя повторения чередований. Для проверки нулевой гипотезы о равной вероятности попадания в любую из целевых рук используется биномиальный тест и обобщенные линейные модели для чередующихся и повторяющихся частотных данных (Калуев и др., 2022).

https://t.me/medicina_free

220

ПРИЛОЖЕНИЕ 3.

ХРОНИЧЕСКИЙ НЕПРЕДСКАЗУЕМЫЙ СТРЕСС (ХНС)

Примерный пятинедельный протокол ХНС на зебраданио (Калуев и др.,

2022; Demin et al., 2020). Протокол стресса, его длительность, а также набор конкретных стрессоров и их последовательность в батарее могут варьировать в зависимости от обстоятельств и целей исследования.

День 1. Предъявление хищника (две 8-см, взрослые голубые мраморные гурами Trichogaster trichopterus) в течение 24 ч*

День 2. Конспецифичное воздействие визуально отличающейся линии зебраданио (20 цветных GloFish® того же возраста) в течение

24 ч*

День 3. Преследование сачком в течение 20 мин → темнота в течение 24 ч*

День 4. Скученность (10 особей/л в небольшом аквариуме на 6 л) в

течение 6 ч → тест на построение косяка в течение 10 мин (5 особей на 1.5-л аквариум, аналогичный аппарату ТНА) → добавление 6 л

воды из аквариума с хищниками (гурами) в домашний аквариум с экспериментальной рыбой*

День 5. Скученность (10 рыб/л), стресс в незнакомой среде

(размещение в 6-л красном круглом пластиковом ведре) на 8 ч,

содержащей феромон тревоги (30 мл, извлеченный из 3 зебраданио

**) → перенос в домашний аквариум

День 6. Депривация пищи (голод) в течение 24 часов с добавлением феромона тревоги (30 мл от 3 зебраданио**) и 6 л воды из аквариума с хищником (гурами) в домашний аквариум

https://t.me/medicina_free