3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

141

и выше тревога). Зебраданио также чувствительны к уровню внешнего освещения в лаборатории. Так, например, содержащиеся в лаборатории на верхних полках аквариумы располагаются ближе к источнику света (на потолке), чем находящиеся на нижних полках аквариумы, и

содержащиеся в них зебраданио имеют более высокий уровень базовой тревоги (Калуев и др., 2022a; Lieggi et al., 2020). Данная ситуация, однако,

не является уникальной для рыб, и часто распространена в лабораториях,

работающих на крысах и мышах. В то же время зебраданио, в отличие от грызунов, оказываются нечувствительны к личности экспериментаторов

(De Abreu and Kalueff, 2021), запахам в лаборатории, а также менее чувствительны к эффекту батареи тестов (Калуев, 2022; Калуев и др.,

2022a; Lieggi et al., 2019). Таким образом, скрининговые платформы на зебраданио оказываются более устойчивыми к воздействию ряда распространенных экспериментальных средовых факторов, и,

следовательно, могут генерировать более надежные и воспроизводимые данные при доклинических испытаниях препаратов.

Особенности нейроанатомии мозга зебраданио также накладывают определенные концептуальные ограничения на использование данных лабораторных животных в моделировании заболеваний ЦНС и доклиническом тестировании. Например, зебраданио и другие костные рыбы лишены коры мозга и гиппокампа (Panula et al., 2010). При этом в мозге зебраданио существуют аналогичные структуры, которые подобны таковым у млекопитающих и позволяют использовать данную модель в доклинических исследованиях. Так, у зебраданио отсутствуют выраженные дофаминергические популяции среднего мозга, такие как черная субстанция и вентральная область покрышки (Panula et al., 2010).

Несмотря на это, рыбы демонстрируют поведение, связанное с активацией этих областей и чувствительное к фармакологической

https://t.me/medicina_free

142

стимуляции, нацеленной на модуляцию дофаминергической системы

(Panula et al., 2006).

При работе с моделями заболеваний мозга важно также учитывать специфику физиологии ЦНС зебраданио. Так, зебраданио характеризуются высокой нейрорегенерацией даже во взрослом возрасте

(Zabegalov et al., 2021). Например, их спинной мозг сростается после перерезки, чего (из-за образования глиальных шрамов) не происходит у млекопитающих и человека. Повышенная нейрорегенерация в ЦНС зебраданио проявляется также в наличии многочисленных нейрогенных зон во взрослом состоянии, что может осложнить тестирование препаратов для терапии нейродегенерации (Bashirzade et al., 2022), так как в этом случае может быть трудно отделить вклад в улучшение от самого препарата на фоне высокой нейрорегенерации (Zabegalov et al., 2021).

Концептуальной проблемой также является сложность моделирования (на животных) заболеваний мозга как таковых, поскольку ни один модельный объект не в состоянии отразить всю сложность работы мозга и поведения человека в норме и патологии. Другой проблемой является моделирование специфических заболеваний ЦНС в рамках более крупного кластера (например, страха или фобий вместо общей генерализованной тревоги), а также моделирование болезней развития ЦНС, основанных на материнской депривации, поскольку у зебраданио отсутствует родительское поведение как таковое. Также следует отметить, что нейроповеденческие модели и тесты на рыбах до сих пор не включены в одобренные национальные и международные стандарты доклинических исследований фармакологически активных препаратов, что существенно тормозит введение зебраданио в качестве эффективной платформы для биоскрининга широкого спектра нейротропных веществ.

https://t.me/medicina_free

143

В целом, поиск и создание новых фармацевтических нейротропных препаратов требует активного внедрения в доклинические исследования новых модельных организмов, в особенности, зебраданио, особенности биологии которых делает данный модельный организм незаменимым инструментом в трансляционной биомедицине (Kolesnikova et al., 2022).

Несмотря на отдельные рассмотренные выше ограничения моделей на зебраданио, его кумулятивная полезность как модельного организма существенно превышает недостатки, позволяя рассматривать зебраданио как чрезвычайно перспективный и стратегически важный организм для изучения ЦНС.

https://t.me/medicina_free

144

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день зебраданио является одним из самых востребованных в биомедицине животных, занимая второе место (после мышей) по количеству использованных животных в экспериментах. Одно из очевидных преимущество водных лабораторных животных для моделирования патологий ЦНС заключается в простоте проведения экспериментальных (например, генетических, физиологических или фармакологических) воздействий. Кроме того, поведенческие фенотипы,

генетические факторы риска и чувствительность зебраданио к фармакологически активным соединениям часто демонстрируют высокую степень сходства у рыб с грызунами и человеком.

Использование зебраданио также не только увеличивает пропускную способность для фармацевтических и химических компаний,

но и соответствует 3R-принципам гуманного биоэкспериментирования

(Cassar et al., 2020), особенно в части ‘replace’ (в частности - замены грызунов на рыб как более простой вид позвоночных животных). Однако внедрение данных акватических моделей в доклинических исследованиях фармацевтических веществ, и особенно нейротропных препаратов, в

России остается на очень низком уровне, отражая, по нашим оценкам за последние 5 лет, лишь <0.5% от всей научной литературы по зебраданио.

Диссертационное исследование использовало комплексный скрининг на зебраданио малых нейротропных молекул (многие из которых не были протестированы ранее и обладают выраженной селективностью по отношению к конкретным мишеням) и охватывает большой спектр экспериментальных воздействий как с точки зрения физиологических систем, так и поведенческих фенотипов. В работе был использован новый модельный организм – зебраданио – и задействованы

https://t.me/medicina_free

145

стремительно развивающаяся область ИИ, в том числе нейрональные сети, для разработки платформы, позволяющей оценить соответствие определенных препаратов классам при помощи вероятностной оценки.

Проведенное исследование было направлено на разработку и внедрение в использование зебраданио в качестве платформы для тестирования нейроактивных молекул in vivo и, в конечном итоге,

содействовало решению задачи быстрого, эффективного и целевого фармакологического скрининга новых психоактивных веществ для их дальнейшего ввода в клиническую практику. Результатом исследования также стало научно-методологическое обоснование создания платформ для эффективного скрининга нейроактивных молекул на рыбах зебраданио (с использованием фенотипических нейрофармакологических библиотек, молекулярного моделирования и систем ИИ), для поиска новых методов фармакотерапии заболеваний мозга человека.

В целом, исследование согласуется с целями и задачами персонализированной медицины, в рамках приоритета научно-

технологического развития РФ (Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов). Примененный подход может быть использован для поиска новых препаратов для лечения различных заболеваний мозга, в том числе более эффективных, чем существующие,

а также препаратов, обладающих персонализированными свойствами.

Практические рекомендации

Применение ИИ, построение габитуома и использование методов трехмерного нейрофенотипирования зебраданио может быть применено для анализа тестируемых нейротропных препаратов в рамках доклинических исследований. Вибрационные спектры и оценка

https://t.me/medicina_free

146

изменения окраса зебраданио могут быть рекомендованы для включения в биоскрининговые платформы для тестирования нейротропных препаратов на зебраданио. Разработанный 11-недельный протокол хронического стресса (ХНС) на зебраданио является новой моделью для изучения нейротропного действия антидепрессантных,

анксиолитических и противовоспалительных препаратов, а также их комбинаций. Подготовленные по материалам диссертации два учебных пособия в настоящее время рекомендованы НМИЦ им. В.А. Алмазова МЗ РФ для подготовки специалистов по специальности “патофизиология”, и

могут также быть использованы для подготовки специалистов по специальности “фармакология, клиническая фармакология”, “нейробиология” и “физиология человека и животных”.

Новый автоматизированный метод видеорегистрации (SIM в ПО

EthoVision XT) способен с высокой точностью оценивать поведение зебраданио в группе, двунаправленно чувствителен к экспериментальным манипуляциям, влияющим на тревожность, и может быть рекомендован к использованию при скрининге нейротропных препаратов на рыбах.

Зебраданио являются чувствительной моделью для скрининга серотонинергических препаратов и их взаимодействий, что может быть использовано для оценки их нейротоксичности и рисков развития СС. В

целом, зебраданио является высокочувствительным модельным организмом к действию широкого спектра нейротропных препаратов, и

может быть рекомендован для более активного включения в скрининговые платформы и существующие стандарты доклинических испытаний лекарственных средств.

https://t.me/medicina_free

147

ВЫВОДЫ

1.Взрослые зебраданио демонстрируют ярко выраженных судорожный эффект при воздействии конвульсантов с различными механизмами действия, сопровождающийся изменением экспрессии маркерных генов в мозге.

2.Разработан новый автоматизированный метод видеорегистрации (SIM

модуль ПО EthoVision XT), с высокой точностью оценивающий поведение зебраданио в группе (в ТПК), которое двунаправленно чувствительно к экспериментальным манипуляциям, влияющим на уровень локомоции и тревожности.

3.Зебраданио при действии серотонинергических агентов и их комбинаций демонстрируют характерный фенотип, который представляет у рыб состояние, подобное серотониновому синдрому

(СС) в клинике.

4.Окраска кожи зебраданио меняется в зависимости от воздействий нейротропных фармацевтических препаратов, и может быть использована в качестве дополнительного биомаркера для быстрого прогнозирования их нейротропного профиля.

5.Реакция привыкания (габитуом) в ряде тестов на новизну (ТОП, ТНА)

у зебраданио чувствительна к действию анксиолитических и анксиогенных препаратов, и может использоваться для дополнительного скрининга нейротропных (в том числе ноотропных и анксиотропных) препаратов.

6.Разработан новый метод оценки поведения с использованием трехмерных локомоторных траекторий, который позволяет получить более точные поведенческие профили препаратов, чем стандартные

2D модели. Применение методов машинного обучения успешно

https://t.me/medicina_free

148

кластеризует вместе (по локомоторным траекториям рыб) препараты

сходного профиля действия.

7.Скополамин и атропин вызывают мягкий анксиогенно-подобный профиль у зебраданио, отражая «аффективный» аспект действия делириантных препаратов на ЦНС.

8.При анализе нейротропных веществ природного происхождения

(ареколин, экстракт кавы) разработан и продемонстрирован принципиально новый простой метод оценки действия фармацевтических препаратов, основанный на анализе частотных спектров вибрации при движении зебраданио.

9.Острый прием ареколина увеличивал плотность косяка, социальное предпочтение и уровень норадреналина и серотонина в мозге, снижал оборот серотонина, а также активировал ранние протоонкогены c-fos и

c-jun в мозге.

10.Хроническое воздействие ареколина повышало экспрессию в мозге специфичных для М2-микроглии генов-биомаркеров egr2 и ym1

(таким образом, вовлекая микроглиальные механизмы в потенциальные эффекты долгосрочных эффектов). Острое 2-часовое прекращение введения ареколина вызывало у зебраданио анксиогенное поведение, подобное синдрому отмены.

11.Экстракт кавы и кавалактоны вызывали дозозависимое торможение поведения, усиливали экспрессию в мозге ранних протоонкогенов c- fos и c-jun, повышали уровень моноаминов в мозге и снижали уровень кортизола. Хроническое 7-дневное воздействие кавы вызывало аналогичные поведенческие эффекты, не изменяло уровень кортизола и не вызывало абстинентного состояния после прекращения приема.

12.Хроническое действие кавы активировало ряд микроглиальных (iNOS, Egr-2, CD11b), астроцитарных (C3, C4B, S100a), эпигенетических

https://t.me/medicina_free

149

(ncoa-1) и провоспалительных (IL-1β, IL-6, TNFa) биомаркерных генов, подавляла CD206 и IL-4 и не влияла на основные апоптотические гены в мозге. Таким образом, полученные данные указывают на вовлечение нейроиммунных процессов в механизм хронического центрального действия кавалактонов.

13.Разработанный 11-недельный протокол хронического стресса зебраданио является новой моделью для изучения действия антидепрессантных/анксиолитических и противовоспалительных препаратов.

14.Поведенческое фенотипирование с использованием ИИ позволяет по траекториям движений рыб в ТНА достаточно точно кластеризовать вместе фармакологически подобные нейротропные соединения, тем самым позволяя предсказать их возможный общий механизм фармакологического действия.

15. Обнаружены сильные нейроактивные свойства новых производных фенилэтиламина, замены в N-бензиловой части молекул которых модулируют локомоцию, а замены в фенетиламиновой части – модулируют тревожное поведение зебраданио, также влияя на метаболизм серотонина и дофамина в мозге, что указывает на их потенциальное клиническое использование и риск злоупотребления

(аддикции).

16.На примере широко спектра нейротропных веществ продемонстрированы эффективность и чувствительность зебраданио в качестве животной модели для изучения действия нейротропных препаратов, в т.ч. в рамках сформулированной концепции высокопроизводительного скрининга данных препаратов на зебраданио.

https://t.me/medicina_free

150

17.На основании приведенных данных, дано научно-методическое обоснование созданию биоскрининговых платформ на основе зебраданио и их использования в доклинических исследованиях нейротропных фармацевтических препаратов in vivo.

https://t.me/medicina_free