3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Сосудистая_хирургия_по_Хаймовичу_Том_1_Ашер_А_,_Покровский_А_В_

тролируемого утолщения интимы, приводящего к уменьшению просвета. Сложные процессы ремоделирования и заживления, возникающие в артерии при наличии атеросклероза, объясняют некоторые особенности структуры бляшки, способствующие изолированию поражения, стабилизации кровотока, сохранению диаметра просвета и предотвращению разрыва бляшки [54].

Похожие реакции возникают в ответ на сосудистые вмешательства, такие как ангиопластика, эндартерэктомия и сосудистое шунтирование. Пролиферативный ответ интимы, возникающий после вмешательства, является частью процесса заживления, обычно самоограничивающийся и регулирующийся особенностями потока и сосудистой геометрии. Не контролируемая гиперплазия интимы и рестеноз являются результатом неспособности восстановить удовлетворительно стабильную изолинию касательного и растягивающего напряжения стенки после вмешательства. Поэтому маловероятно, что манипуляция с медиаторами пролиферации гладкой мускулатуры, включая генетическое нацеливание во время ангиопластики, приведет к уменьшению частоты рестено-

Рис. 10.10. Сагиттальный срез дна артерии в экспериментальном анастомозе, наложенном конец-в-бок. Гиперплазия интимы развилась в области разделения потока и застоя, где касательное напряжение низкое и колеблющееся по направлению. Такая форма утолщения интимы регулируется гемодинамически. (С разрешения из Bassiouny H.S., White S., et al. Anastomotic intimal hyperplasia: mechanical injury or flow induced? J Vasc Surg 1992, 15: 708–717.)

за, если механические и гемодинамические условия не приводят к значительному самоограничению ремоделирования [55]. Дальнейшее углубление понимания контрольных механизмов пролиферации интимы может привести к формированию способов системного и локального фармакологического контроля, которые вместе с улучшенным контролем за системными и локальными гемодинамическими факторами приведут к предотвращению или контролю гиперплазии интимы.

Утолщение интимы как результат субнормального касательного напряжения стенки

Хроническая редукция скорости и объема кровотока подвергают эндотелий низкому уровню касательного напряжения, что приводит к утолщению интимы. В экспериментальных исследованиях на кроликах, сонные артерии которых подвергались повторяющимся эпизодам увеличения и уменьшения кровотока, было показано, что прогрессивное утолщение интимы происходит в течение периодов времени, когда в артерии регистрируется низкое касательное напряжение стенки [56, 57]. В экспериментах сначала в левой сонной артерии кролика на 4 недели увеличивали кровоток путем создания артериовенозной фистулы (АВФ) между левой общей сонной артерией и наружной яремной веной. Левая общая сонная артерия расширялась в ответ на увеличение кровотока и касательного напряжения стенки. Утолщения интимы за этот период времени не произошло. После 4 недель периода увеличенного кровотока АВФ была закрыта, что привело к немедленной редукции кровотока до нормальных величин и снижению касательного напряжения стенки до субнормальных значений. После 6 недель нормального кровотока и низкого касательного напряжения стенки произошло значительное утолщение интимы. Второй и третий циклы увеличенного и нормального кровотока, создаваемые путем открытия и закрытия фистулы, показали, что утолщение интимы возникает только в периоды сниженного кровотока и низкого касательного напряжения стенки (рис. 10.11). Это показывает, что утолщение интимы может происходить в ответ на воздействие гемодинамических факторов, таких как субнормальное касательное напряжение стенки, и не требует повреждения эндотелия или артериальной стенки. Субнормальный уровень касательного напряжения стенки напря-

мую связан с утолщением интимы, что говорит о том, что утолщение интимы является приспособительным ответом на гемодинамическое воздействие на артерию. Утолщение интимы в этих условиях представляет из себя и фиброзно-клеточную гипертрофию и гиперплазию, при этом гладкомышечные клетки (ГМК) служат преобладающим источником утолщения интимы, обусловленной низким касательным напряжением стенки [58].

Гиперплазия интимы в стентах

Для лечения сосудистых заболеваний широко применяются внутрисосудистые стенты и стент-графты [59, 60]. Гиперплазия интимы — главная причина внутристентового рестеноза в коронарных и периферических артериях [61, 62]. Внутристентовый рестеноз соответствует процессу заживления раны. Этот процесс включает депонирование раннего тромба, острое воспаление, развитие грануляционной ткани, и в конечном итоге, пролиферацию гладкомышечных клеток и синтез экстрацеллюлярного матрикса [64]. Для предотвращения внутристентового рестеноза предпринимались различные вмешательства, включая брахитерапию [61] и стенты с лекарственным покрытием. Стенты с лекарственным покрытием, например, значительно снизили внутристентовый рестеноз и не вызывают воспаление [65]. Радиоактивные стенты также снижают внутристентовый рестеноз [66–68]. Однако в других исследованиях было показано, что бляшка растет в направлении кнаружи от стента [69].

Модификация материалов стентов и стент-графтов обеспечила значительное улучшение понимания патологических процессов. Например, на овцах сравнивалась биосовместимость и характеристика стент-графтов и обычных стентов; результаты показали, что все исследуемые стент-графты вызывали воспалительную реакцию сосудистой стенки и гиперплазию неоинтимы. Полиэстерпокрытые эндопротезы вызывали выраженную реакцию тканей с образованием 50% стеноза. В ПТФЭ-покрытых стент-графтах определялись замедленная эндотелизация и менее выраженный стеноз. Обычные стенты показали себя с лучшей стороны в плане образования интимы и вызывали наименьший воспалительный ответ [70]. Для улучшения характеристик и биосовместимости стентграфтов необходимы дальнейшие исследования.

Молекулярные механизмы гиперплазии интимы

Гиперплазия интимы характеризуется миграцией и пролиферацией гладкомышечных клеток сосудов (ГМКС), что вызвано повреждением, воспалением и изменением гемодинамических условий. Существует рабочая гипотеза молекулярных механизмов. Дифференцированные ГМКС сохраняются в состоянии сокращения, что достигается взаимодействием компонентов основной мембраны с подтипами специфического интегрина (рис. 10.12А). Гепарансульфат протеогликаны, сосудорасширяющие агенты, увеличивающие цикло-АМФ или цикло-ГМФ, усиливают неподвижность. Повреждение, воспалительная инфильтрация или механическое растяжение активируют гепараназы и каскад протеаз, которые, в свою очередь, регулируют взаимодействие между экстрацеллюлярным матриксом и ГМКС. Передача сигнала снаружи внутрь посредством интегринов инициирует фенотипический переход из контрактильного состояния в секреторное. Этот процесс вовлекает быструю индукцию генов, регулирующих ответ факторов роста, хемоаттрактантов, экспрессию поверхностных ин-

тегринов новых клеток и экстрацеллюлярных молекул матрикса (рис. 10.12Б).

Другие пептидные агенты, такие как тромбин, эндотелин-1, ангиотензин-II, воспалительные цитокины действуют совместно с целью инициирования пролиферации и миграции, при условии что ориентиры экстрацеллюлярного матрикса, такие как связывающийся фибронектин с интегринами, правильны. Фибронектин полимеризуется в волокна, обеспечивающие пути миграции. Остеопонтин также оказывает миграционный эффект на ГМКС, он вызывает медиаторное действие после соединения с avb3-ин- тегрином. Витронектин также способствует миграции [71]. Недавно было показано, что активация крупной митоген-активи- рованной протеинкиназы-1 приводит к регуляции размножения гладкомышечных клеток [72]. Дальнейшие исследования регуляторных путей пролиферации и миграции ГМКС прояснят механизмы, контролирующие гиперплазию интимы.

Литература

1.Mills JL, Fujitani RM, Taylor SM. The characteristics and anatomic distribution of lesions that cause reversed vein graft failure: a five-year prospective study. J Vasc Surg 1993; 17: 195–206.

2.Garratt KN, Edwards WD, et al. Differential histopathology of primary atherosclerotic and restenotic lesions in coronary arteries and saphenous vein bypass grafts: analysis of tissue obtained from 73 patients by directional atherectomy. J Am Coll Cardiol, 1991; 17: 442–448.

3.Thatte HS, Khuri SF. The coronary artery bypass conduit: I. Intraoperative endothelial injury and its implication on graft patency. Ann Thorac Surg 2001; 72(6): S2245–52; discussion S2267–70.

4.Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990’s. Nature 1993; 362: 801–809.

5.Jackson CL, Reidy MA. Basic fibroblast growth factor: its role in the control of smooth muscle cell migration. Am J Pathol 1993; 143: 1024–1031.

6.Zubilewicz T, Wronski J, et al. Injury in vascular surgery-the intimal hyperplastic response. Med Sci Monit 2001; 7(2): 316–24.

7.Kalmes A, Daum G, Clowes AW. EGFR transactivation in the regulation of SMC function. Ann N Y Acad Sci 2001; 947: 42–54; discussion 54–5.

8.Reidy MA, Fingerle J, Lindner V. Factors controlling the development of arterial lesions after injury. Circulation 1992;86 (Suppl III): III-43–III-46.

9.Ferns GA, Raines EW, et al. Inhibition of neointimal smooth muscle accumulation after angioplasty by antibody to PDGE Science 1991; 253: 1129–1132.

10.Clowes AW, Reidy MA. Prevention of stenosis after vascular reconstruction: pharmacologic control of intimal hyperplasia-a review. J Vasc Surg 1991; 13: 885–891.

11.McCready R, Price M, et al. Failure of antiplatelet therapy with ibuprofen (Motrin) to prevent neointimal fibrous hyperplasia. J Vasc Surg 1985; 2(1): 205–213.

12.Franklin SM, Faxon DP. Phamacological prevention of restenosis after coronary angioplasty: review of randomized clinical trials. Coron Artery Dis 1993; 4: 232–242.

13.Glagov S, Zarins CK. et al. Hemodynamics and atherosclerosis: insights and perspectives gained from studies of human arteries. Arch Pathol Lab Med 1988; 112: 1018–1031.

14.Zarins CK. Adaptive responses of arteries. J Vasc Surg 1989;

9:382.

15.Glagov S, Weisenberg E, et al. Compensatory enlargement of human atherosclerotic coronary arteries. N Engl J Med 1987;

316:1371–1375.

16.Davies PF, Dewey CF, et al. Influence of hemodynamic forces on vascular endothelial function: in vitro studies of shear stress and pinocytosis in bovine aortic cells. J Clin invest 1984; 73: 1121–1129.

17.McAllister TN, Du T, Frangos JA. Fluid shear stress stimulates prostaglandin and nitric oxide release in bone marrow-derived preosteoclast-like cells. Biochem Biophys Res Commun 2000 Apr 13; 270(2): 643–8.

18.Palumbo R, Gaetano C, et al. Different effects of high and low shear stress on platelet-derived growth factor isoform release by endothelial cells: consequences for smooth muscle cell migration. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22(3): 405–11.

Рис. 10.12. Рабочая гипотеза гиперплазии интимы. (А) Неподвижное состояние. Неподвижные гладкомышечные клетки окружены основной мембраной из коллагена IV типа и ламинина, которая богата протеогликан-сульфат-гепаринами, включая синдеканы. Связывание с β1-интегринами совместно с действием циклических нуклеотидов (цикло-АМФ, цикло-ГМФ) и неизвестных медиаторов траснформирующего фактора роста-β (TGF-β) приводит к образованию сигналов, поддерживающих неподвижность. Переход от неподвижности требует реорганизации компонентов матрикса, что инициируется экстрацеллюлярными протеазами, включая металлопротеиназы (ММП) (MMP-англ.), урокиназный активатор плазминогена (УАП) (uPA-англ.), дезинтегрин и протеинсодержащие металлопротеиназы (ADAMs). (Б) Активированное состояние. В синтезированных гладко-мышечных клетках основная мембрана разрушена, клетки вошли в контакт с компонентами интерстициального матрикса, которые включают мономерный коллаген I и II типов и фибронектин. Они также связываются с интегрином, особенно c α5β1- и αvβ3- интегринами, которые обеспечивают сигналы, запускающие миграцию и пролиферацию, а фибронектин обеспечивает пути миграции. Активация гладко-мышечных клеток связана с повышающей регуляцией ММП-1 и ММП-3, что способствует реорганизации интерстициального матрикса. (С разрешения из Newby A.C., Zaltsman A.B. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J Pathol 2000; 190(3): 300–9.)

PDGF — тромбоцитарный фактор роста;

FGF-2 — фактор роста фибробластов.

19.Redmond EM, Cullen JP, et al. Endothelial cells inhibit flowinduced smooth muscle cell migration: role of plasminogen activator inhibitor-i. Circulation 2001; 103(4): 597–603.

20.Ward MR, Tsao PS, et al. Low blood flow after angioplasty augments mechanisms of restenosis: inward vessel remodeling, cell migration, and activity of genes regulating migration. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21(2): 208–13.

21.Olesen SR, Clapham DE, Davies PE. Hemodynamic shear stress activates a K current in vascular endothelial cells. Nature 1988; 331: 168–170.

22.Leung DYM, Glagov S, Mathews MB. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science 1976; 191: 475.

23.Glagov S, Zarins CK. Intimal hyperplasia: an adaptive response or a pathologic process? J Vasc Surg 1989; 10: 571–573.

24.Raitakari OT, Celermajer DS. Flow-mediated dilatation. Br J Clin Pharmacol 2000; 50(5): 397–404.

25.Zarins CK, Zatina MA, et al. Shear stress regulation of artery lumen diameter in experimental atherogenesis. J Vase Surg 1987; 5: 413–420.

26.Kamiya A, Togawa T. Adaptive regulation of wall shear stress to flow change in the canine carotid artery. Am J Physiol 1980; 239: H14–H21.

27.Masuda H, Bassiouny H, et al. Artery wall restructuring in response to increased flow. Surg Forum 1989; 40: 285–286.

28.Langille BL, O’Donnell F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-depend- ent. Science 1986; 231: 405–407.

29.Bassiouny HF, Lieber BB, et al. Quantitative inverse correlation of wall shear stress with experimental intimal thickening. Surg Forum 1988; 39: 328–330.

30.Zarins CK, Giddens D, et al. Carotid bifurcation atherosclerosis: quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circ Res 1983; 53: 502–514.

31.Ku DN, Giddens DR, et al. Pulsatile flow and atherosclerosis in the human carotid bifurcation: positive correlation between plaque location and low and oscillation shear stress. Arteriosclerosis 1985; 5: 293–302.

32.Beere PA, Glagov S, Zarins CK. Experimental atherosclerosis at the carotid bifurcation of the cynomolgus monkey: localization, compensatory enlargement and the sparing effect of lowered heart rate. Arterioscler Thromb 1992; 12: 1245–1253.

33.Beere PA, Glagov S, Zarins CK. Retarding effect of lowered heart rate on coronary atherosclerosis. Science 1984; 226: 180–182.

34.Leung DYM, Glagov S, Mathews MB. Flastin and collagen accumulation in rabbit ascending aorta and pulmonary trunk during postnatal growth: correlation of cellular synthetic response with medial tension. Circ Res 1977; 41: 316–323.

35.Zarins CK, Weisenberg F, et al. Differential enlargement of artery segments in response to enlarging atherosclerotic plaques. J Vasc Surg 1988; 7: 386–394.

36.Glagov S, Zarins CK, et al. Mechanical functional role of non-ath- erosclerotic intimal thickening. Front Med Biol Eng 1993; 5: 37–43.

37.Masawa N, Glagov S, et al. Intimal thickness normalizes mural tensile stress in regions of increased intimal area and artery size at the carotid bifurcation. Arteriosclerosis 1988; 8: 612a.

38.Dobrin PB, Littooy FN, Endean ED. Mechanical factors predisposing to intimal hyperplasia and medial thickening in autogenous vein grafts. Surgery 1989; 105: 393–400.

39.Glagov S, Giddens DP, et al. Hemodynamic effects and tissue reactions at graft to vein anastomosis for vascular access. In: Sommer BC, Henry ML, eds. Vascular access for hemodialysis. Precept Press, 1991: 320.

40.Kleinstreuer C, Hyun S, et al. Hemodynamic parameters and early intimal thickening in branching blood vessels. Crit Rev Biomed Eng 2001; 29(1): 1–64.

41.Langille BL, Bendeck MP, Keeley FW. Adaptations of carotid arteries of young and mature rabbits to reduce carotid blood flow. Am J Physiol 1989; 256: H931–R939.

42.Vyalov S, Langille BL, Gotlieb AI. Decreased blood flow rate disrupts endothelial repair in vivo. Am J Pathol 1996; 149(6): 2107–18.

43.Mattsson EJ, Kohler TR, et al. Increased blood flow induces regression of intimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997; 17(10): 2245–9.

44.Coats WD Jr, Currier JW, Faxon DP. Remodelling and restenosis: insights from animal studies. Semin Interv Cardiol 1997; 2(3): 153–8.

45.Miller MJ, Kuntz RE, et al. Frequency and consequences of intimal hyperplasia in specimens retrieved by directional atherectomy of native primary coronary artery stenoses and subsequent restenosis. Am J Cardiol 1993; 71: 652–658.

46.Megerman J, Hamilton G, et al. Compliance of vascular anastomoses with polybutester and polypropylene su. tures. J Vasc Surg 1993; 18(5): 827–34.

47.Megeman J, Abbott WM. Compliance in vascular grafts. In: Wright C, ed. Vascular grafting. Boston: John Wright PSB, 1983: 344–364.

48.Hasson J, Megerman J, Abbott WM. Increased compliance near vascular anastomoses. J Vasc Surg 1985; 2: 419–423.

49.Lyon R, Runyon-Hass A, et al. Protection from atherosclerotic lesion formation by reduction of artery wall motion. J Vasc Surg 1987; 5(1): 59–67.

50.Bassiouny HS, White S, et al. Anastomotic intimal hyperplasia: mechanical injury or flow induced? J Vasc Surg 1992; 5: 708–717.

51.White SS, Zarini CK, et al. Hemodynamic patterns in two models of end-to-side vascular graft anastomoses: effects of pulsatility, flow division, Reynolds number and hood length. J Biomech Eng 1993; 115: 104–111.

52.Giddens EM, Giddens DP, et al. Exercise flow conditions eliminate stasis at vascular graft anastomoses. In: Schneck DJ, Lucas CL, eds. Biofluid dynamics, 3rd ed. Biomedical engineering monograph series. New York: New York University Press, 1991; 255–267.

53.Bassiouny HS, Krievins D, et al. Distal arteriovenous fistula inhibits experimental anastomotic intimal thickening. Surg Forum 1993; 44: 345–346.

54.Stary HC, Blankenhorn DH, et al. A definition of the intima of human arteries and of its atherosclerosis-prone regions: a report from the committee on vascular lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heat Association. Circulation 1992; 85: 391–405.

55.Glagov S. Intimal hyperplasia, vascular modeling and the restenosis problem. Circulation 1994; 89: 2888–2891.

56.Singh TM, Zhuang YJ, et al. Intimal hyperplasia in response to reduction of wall shear stress. American College of Surgeons, 83rd Annual Clinical Congress, Surgical Forum 1997; 444–446.

57.Zhuang YJ, Singh TM, et al. Sequential increases and decreases in blood flow stimulates progressive intimal thickening. Eur J Vasc Endovasc Surg 1998; 16(4): 301–10.

58.Sho M, Sho E, et al. Subnormal shear stress-induced intimal thickening requires medial smooth muscle cell proliferation and migration. Exp Mol Pathol 2002 Apr; 72(2): 150–60.

59.Al Suwaidi J, Berger PB, Holmes DR Jr. Coronary artery stents. JAMA 2000; 284(14): 1828–36.

60.Zarins CK, White RA, et al. The AneuRx stent graft: four-year results and worldwide experience 2000. J Vasc Surg 2001; 33(2 Suppl): S135–45.

61.Ajani AE, Kim HS, Waksman R. Clinical trials ofvascular brachytherapy for in-stent restenosis: update. Cardiovasc Radiat Med 2001; 2(2): 107–13.

62.Lowe HC, Oesterle SN, Khachigian LM. Coronary instent restenosis: current status and future strategies. J Am Coli Cardiol 2002; 39(2): 183–93.

63.Eton D, Warner DL, et al. Histological response to stent grafttherapy. Circulation 1996; 94(9 Suppl): II182–7.

64.Virmani R, Farb A. Pathology of in-stent restenosis. Curr Opin Lipidol 1999; 10(6): 499–506.

65.Hong MK, Kornowski R, et al. Paclitaxel-coated GianturcoRoubin II (GR II) stents reduce neointimal hyperplasia in a porcine coronary in-stent restenosis model. Coron Artery Dis 2001; 12(6): 513–5.

66.Waksman R, Bhargava B, et al. Intracoronary radiation with gamma wire inhibits recurrent in-stent restenosis. Cardiovasc Radiat Med 2001; 2(2): 63–8.

67.Chan AW, Moliterno DJ. In-stent restenosis: update on intracoronary radiotherapy. Cleve Clin J Med 2001; 68(9): 796–803.

68.Gurberg L, Waksman R. Intravasscular radiation for the prevention of recurrence of restenosis in coronary arteries. Expert Opin Investig Drugs 2001; 10(5): 891–907.

69.Wexberg P, Kirisits C, et al. Vascular morphometric changes after radioactive stent implantation: a doseresponse analysis. J Am Coli Cardiol 2002; 39(3): 400–7.

70.Cejna M, Virmani R, et al. Biocompatibility and performance of the Wallstent and several covered stents in a sheep iliac artery model. J Vasc Interv Radiol 2001; 12(3): 351–8.

71.Newby AC, Zaltsman AB. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J Pathol 2000; 190(3): 300–9.

72.Luo H, Reidy MA. Activation of big mitogen-activated protein kinase-1 regulates smooth muscle cell replication. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22(3): 394–9.

Ежегодно в США более чем у 200 тыс. человек появляются симптомы хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. Наиболее частой причиной является атеросклероз. Симптоматика выражается в явлениях перемежающейся хромоты или критической ишемии, угрожающей сохранности конечностей. Хирургическое лечение артериальной патологии нижних конечностей предлагается при любой возможности в случаях надвигающейся угрозы ампутации. Более того, существенной пользы от реваскуляризации можно ожидать и у тех пациентов, чей образ жизни сильно ограничивается явлениями перемежающейся хромоты.

Опробован целый ряд методов лечения при ишемии нижних конечностей, но основой остается реваскуляризация открытым либо эндоваскулярным способом. Обе методики оказались весьма эффективны в уменьшении выраженности этого заболевания. Однако не всем пациентам с ишемией нижних конечностей показано оперативное вмешательство. В некоторых случаях, особенно при диабете, почечной недостаточности или болезни Бюргера, реконструкция технически невозможна из-за отсутствия адекватных путей оттока. У значительной части больных множественные сопутствующие заболевания, часто взаимосвязанные с диффузным атеросклеротическим процессом, препятствуют проведению инвазивного вмешательства. Кроме того, у большой группы пациентов старшей возрастной группы лечение инвалидизирующей перемежающейся хромоты может сопровождаться риском, превышающим ожидаемую пользу. Следовательно, должно приветствоваться развитие новых, менее инвазивных направлений в качестве дополнения к уже существующим методам лечения больных с окклюзирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.

У больных с атеросклеротическим поражением часто развивается коллатеральное кровообращение. Однако коллатеральная сеть никогда не способна полностью компенсировать недостаточность

кровоснабжения, вызванную окклюзией крупных сосудов. Терапевтический ангиогенез является новым направлением, изучающим новообразование коллатеральных кровеносных сосудов, которое стимулируется в ишемизированных тканях введением протеинов ангиогенеза. Восстановление кровотока в ишемизированной конечности посредством ангиогенеза дает возможность обеспечить биологическое «шунтирование» у пациентов с атеросклеротическим окклюзирующим заболеванием. Исследования на животных позволяют предположить, что экзогенное введение ангиогенных факторов, особенно фактора роста фибробластов (FGF) и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), могут усиливать кровоток в зонах ишемии, тем самым улучшая перфузию тканей. Хотя имеется несколько методик введения этих протеинов, наиболее эффективной и наименее инвазивной представляется простая внутримышечная инъекция. Успешное развитие терапевтического ангиогенеза как минимально инвазивного подхода к лечению сосудистой недостаточности могло бы значительно расширить наши возможности в лечении пациентов с критической ишемией и перемежающейся хромотой.

Ангиогенез и артериогенез

В новообразование сосудов вносят свой вклад три разных процесса — васкулогенез, артериогенез и ангиогенез.

1.Васкулогенез является первичным процессом развития новых сосудов во время эмбриогенеза и может играть до конца не выясненную роль в сформировавшихся тканях у взрослого. Этот процесс характеризуется дифференциацией мультипотентных эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки, которые впоследствии формируют первичные кровеносные сосуды [1].

Таблица 11.1. Известные ангиогенные факторы роста

Ангиогенин Ангиопоэтин-1

Эпидермальный фактор роста (EGF) Факторы роста фибробластов:

кислотный (aFGF) и основной (bFGF) Фоллистатин

Гранулоцитарный колониеобразующий фактор (G-CSF) Фактор роста гепатоцитов(HGF) Гипоксия-индуцируемый фактор (HIF-1) Интерлейкин-8 (IL-8)

Лептин

Мидкин Плацентарный фактор роста

Тромбоцитарно-зависимый фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF)

Тромбоцитарно-зависимый фактор роста ВВ (PDGF-BB) Плейотрофин (PTN)

Пролиферин

Трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-α) Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) Альфа-фактор некроза опухолей (TNF-α) Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF)/

фактор сосудистой проницаемости (VPF)

2.Артериогенез происходит в зрелых сосудах и связан с развитием новых «больших» артерий, которые уже имеют полностью сформированную среднюю оболочку (медию). Примером могут служить видимые при ангиографии коллатерали у пациентов с выраженными периферическими или коронарными заболеваниями. Все типы сосудистых клеток, включая гладкомышечные клетки и перициты, вовлечены в формирование этих сосудов.

3.Ангиогенез представляет собой процесс, который также происходит в сформированных тканях и посредством которого новые капилляры развиваются из уже существующей сосуди-

стой сети. Существует множество примеров ангиогенеза. Физиологический ангиогенез сопровождает заживление ран и рост эндометрия, тогда как неоваскуляризация сетчатки и ревматоидный артериит служат примерами патологического ангиогенеза. Развитие опухолей и их метастазов также сопровождается ангиогенезом [2].

Наиболее широко изучались ангиогенез и артериогенез. Для ангиогенеза требуется широкое взаимодействие разнообразных клеток и контроль посредством многочисленных пептидов и других модулирующих факторов. Гипоксия является одним из главных стимулирующих факторов, запускающих ангиогенез [3]. Процесс начинается с протеолитической деградации существующей основной мембраны стенки кровеносного сосуда и окружающего экстрацеллюлярного матрикса. Это сопровождается миграцией эндотелиальных клеток и перицитов гладкомышечных клеток из сосуда в зону ишемии. Затем клетки пролиферируют, продуцируют новые протеины матрикса и основной мембраны, и формируют капиллярную сеть. Деградация матрикса, миграция эндотелиальных, гладкомышечных клеток и перицитов модулируется через взаимодействие множества факторов, включая активаторы плазминогена, металпротеиназы матрикса и их ингибиторы. Имеется множество других дополнительных регуляторов пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток, которые служат важными компонентами процесса ангиогенеза.

Как оказалось, два фактора роста наиболее восприимчивы к инициации ангиогенеза — фактор роста фибробластов (FGF) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), хотя множество промежуточных факторов, таких как гипоксия-индуцированный фактор (HIF-1), фактор-альфа трансформации роста (TGF-α), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), ангиопоэтин и эпидермальный фактор роста (EGF) потребуются для окончательного завершения этого процесса (табл. 11.1). Артериогенез связан с развитием коллатеральных артерий. Одна из гипотез заключается в том, что коллатеральные сосуды развиваются из уже существующих артериол, которые трансформируются после окклюзии крупной питающей артерии. Вновь образовавшийся градиент давления приводит к увеличению объема и скорости кровотока в этих арте-

Моноциты

НАПРЯЖЕНИЕ СДВИГА

Молекулы адгезии

Эндотелиальные клетки

Цитокины

Макрофаги

Цитокины

Рис. 11.1. Клеточные механизмы артериогенеза. Повышенное напряжение сдвига стимулирует проявление ряда генных продуктов, таких как MCP-1 и молекул клеточной адгезии, которые вовлекаются в процесс привлечения и миграции моноцитов. Возникающие изменения являются причиной миграции моноцитов в субинтимальное пространство, где происходит их фенотипическая дифференцировка в макрофаги, которые в свою очередь продуцируют цитокины и факторы роста и тем самым создается предрасположенность к сосудистому ремоделированию (артериогенезу). GMCSFфактор удлиняет время жизни моноцитов/макрофагов через подавление апоптоза этих клеток. MCP-1 — протеиновый хемоаттрактант моноцитов; NOS — синтаза оксида азота; NO — оксид азота; GMCSF — фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов-ма- крофагов; VEGF — фактор роста сосудистого эндотелия; FGF — фактор роста фибробластов; SMC — гладкомышечные клетки.

риолах, и вытекающему отсюда увеличению напряжения сдвига. Возросшее напряжение сдвига приводит к заметной активации эндотелия с соответствующим усилением выраженности протеинового хемоаттрактанта моноцитов (MCP-1) и поверхностных рецепторов эндотелия, которые вовлекаются в процесс созревания моноцитов и их миграции [4–6]. Созревающие моноциты трансформируются в макрофаги. Последние синтезируют ряд цитокинов и факторов роста (включая альфа-фактор некроза опухоли (TNF-a) и основной фактор роста фибробластов (bFGF), которые вовлекаются в артериогенез [7]. Эти протеины стимулируют ремоделирование и расширение артериол, приводя к развитию функциональных коллатералей (рис. 11.1).

Протеины ангиогенеза

Фактор роста сосудистого эндотелия

VEGF (или VEGF-А) является семейством ди-димеров гликопротеинов с массой 34–46 дальтон, впервые открытых в 1983 г. Эти протеины первоначально были расценены как фактор сосудистой проницаемости, хотя уже в 1989 г. выделенный из слизистых фолликулярных клеток VEGF был охарактеризован и клонирован как ангиогенный фактор [8]. Пять изоформ, различающихся по количеству аминокислотных остатков (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206), продуцируются единственным геном за счет изменений при вырезании различных участков матричной РНК [2]. Большинство типов клеток продуцируют несколько изоформ VEGF; однако наиболее часто проявляются VEGF121 и VEGF165. VEGF имеет сигнальную последовательность, которая запускает его секрецию интактными клетками. Таким образом, VEGF в клетках, способных к его продуцированию, секретируется и становится биологически активным. Все пять изоформ имеют сходную биологическую активность, но отличаются по возможности связывания с поверхностью клеток и белками экстрацеллюлярного матрикса. VEGF121 и VEGF165 легко связываются с клетками и матриксом и теоретически более биологически доступны. Большие изомеры (VEGF189 и VEGF206) секретируются менее эффективно и изолируются гепарансульфатом протеогликанов от клеточных поверхностей и экстрацеллюлярного матрикса.

VEGF оказался наиболее действенным регулятором ангиогенеза. Хотя VEGF синтезируется разными типами клеток внутри и вокруг клеточной стенки, этот протеин специфически влияет на клетки эндотелия. VEGF стимулирует пролиферацию клеток эндотелия через связывание с двумя трансмембранными рецепторами тирозинкиназы: flt-1 (VEGFR-1) и KDR/flk-1 (VEGFR-2) [10]. Кроме того, VEGF повышает выживаемость клеток эндотелия — результат, который дополняет его митогенный эффект. VEGF не оказывает прямого влияния на гладкомышечные клетки или перициты, однако опосредованно, через факторы, высвобождаемые эндотелиальными клетками, VEGF может стимулировать миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток. Гипоксия является мощным стимулом проявления VEGF [11]. Транскрипция VEGF матричной РНК отчасти опосредуется соединением гипоксия-ин- дуцируемого фактора-1 с точкой связывания, локализованной на промоуторе VEGF [12]. В действительности, VEGF матричной РНК лабилен; однако в ответ на гипоксию наступает его стабилизация на матричной РНК [13, 14]. Кроме того, гипоксией регулируются проявления рецепторов VEGF [15]. Таким образом, гипоксия в условиях in vivo является мощным стимулом ангиогенеза за счет увеличения транскрипции VEGF и его рецепторов.

Фактор роста фибробластов

Фактор роста фибробластов (FGF) представляет собой семейство структурно гомологичных протеинов от 16 до 24 килодальтон, которые усиливают пролиферацию эндотелиальных клеток, фибробластов и гладкомышечных клеток. В настоящее время известно, что семейство FGF содержит по крайней мере до 20 факторов, гомологичных между собой на 30–70% [16]. В отличие от VEGF классические формы FGF, FGF-1 и FGF-2 (также известные как кислотный и основной фактор роста фибробластов), теряют сигнальную последовательность, которая позволяла прямую секрецию протеинов клетками. Поэтому механизм проявления FGF должен сопровождаться механизмом, поддерживающим секрецию протеинов. FGF не оказывает влияния на сосудистую проницаемость. Биологические эффекты FGF опосредуются четырьмя структурно близкими тирозинкиназными рецепторами, которые имеют широкое проявление [17, 18].

Подобно VEGF, FGF стимулирует ангиогенез и формирование коллатеральных сосудов. Однако FGF также прямо стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток, что может привести к интимальному утолщению и окклюзии сосудов. Таким образом, введение FGF может иметь как позитивные, так и побочные эффекты на сосудистую систему. Более того, систематическое лечение FGF было связано с токсическими эффектами на почки и кровь, каждый из которых мог повлиять на терапевтическую пользу применения этого фактора [19].

Фактор роста гепатоцитов

Недавние исследования выявили протеин — фактор роста гепатоцитов (HGF), также относящийся к семейству ангиогенных факторов роста. HGF является мезенхимальным плейотропным фактором, который регулирует рост, подвижность и морфогенез различных типов клеток [20, 21]. Кроме того, HGF подобно VEGF содержит последовательность, которая разрешает секрецию протеина из клетки, а также он является специфичным фактором роста эндотелия.

Фактор, индуцируемый гипоксией

Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF-1), является разнодимерным фактором транскрипции, который регулирует проявления ряда кислород-зависимых генов. Как было показано, VEGF является истинным геном-мишенью для HIF-1, так как ген VEGF содержит элемент ответа на гипоксию (HRE) в составе своего промоутера, чувствительного к этому фактору [3]. Новым подходом в стимуляции ангиогенеза в ишемизированной мышце может быть ген-переносчик HIF-1, который может имитировать физиологический ангиогенез в ответ на ишемию.

Механизмы доставки препаратов

Одним из основных механизмов, через которые можно внедрить протеины ангиогенеза, является генная терапия. Цель генной терапии заключается в введении рекомбинантной ДНК в клетки или ткани хозяина, которые инициируют или усиливают проявления протеинов, что может изменить течение болезни. В случае терапевтического ангиогенеза генная терапия призвана

увеличить продукцию протеина, который стимулирует образование капилляров или коллатеральных кровеносных сосудов. Подобный эффект можно достигнуть непосредственным введением экзогенных протеинов ангиогенеза в ткани. Однако имеется отличительное преимущество генной терапии над прямым введением протеинов. Белки обычно имеют короткий период полураспада и, следовательно, поддержание биологической активности требует частого или непрерывного введения. В противоположность гену-переносчику, «включенный» ген может вести к высвобождению высокой концентрации белков с терапевтическим эффектом сверх периода ожидания. Более того, при генной терапии вводимый генетический материал может быть «сконструирован» так, что он будет включаться только на специфических клетках-мишенях. Это способствует селективному проявлению белков на специфических клетках в пределах ткани. Эту специфичность нельзя достичь при экзогенном введении белков.

Для успешного переноса гена необходимо, чтобы чужеродный ген преодолел наружную мембрану клетки-хозяина и транспортировался в ядро. Для достижения этого ген сначала встраивается в плазмиды (эписомы), естественным образом окружающие ДНК-молекулу. Доставка плазмид в клетку-хо- зяина и последующее проявление гена является процессом, известным как трансфекция (заражение клеток нуклеиновыми кислотами). Прямой перенос гена (или трансфекция ДНК, лишенной покрытия) представляет собой процесс, посредством которого клетки подвергаются воздействию высокой концентрации плазмид ДНК. Проникновение в ДНК при подобных обстоятельствах происходит путем эндоцитоза. Вследствие гидрофильной природы ДНК клетка-хозяин изменяется и таким образом проявления открытой ДНК ограничиваются. Другой путь связан с переносчиком (вектором), который может быть использован для доставки рекомбинантной ДНК в клетку-хо- зяина. Обычно вирусы используют вектора. Вирусы опосредованно через рецепторный механизм, крайне эффективно транспортируют генетический материал через клеточную мембрану. В настоящее время наиболее эффективным вектором для переноса сосудистого гена в условиях in vivo является аденовирус. Эффективность трансфекции с помощью аденовируса во много раз превышает таковую при воздействии на клетки с открытой ДНК [22]. К сожалению, использование аденовируса для заражения клетки-мишени провоцирует иммунный ответ. Образуются нейтрализующие к аденовирусу антитела, которые устраняют возможность использования аденовирусного вектора в последующем, а также ограничивают продолжительность действия ДНК [23, 24].

Открытая ДНК использована в нескольких моделях ангиогенеза [25–27]. В других моделях трансфекция тканей произведена аденовирусным вектором. Преимуществом метода открытой ДНК является его простота и отсутствие иммунного ответа; таким образом, чужеродная ДНК может быть многократно успешно внедрена. Очевидные недостатки — невозможность достичь высокой эффективности трансфекции и низкая продукция белка. В противоположность этому, использование аденовирусного вектора позволяет достичь высокой экспрессии гена и продукции белка; однако иммунный ответ исключает возможность повторных введений.

Независимо от того, используется открытая ДНК или аденовирусный вектор, ген, кодирующий протеины ангиогенеза, может быть введен в ишемизированные ткани двумя различными способами. Можно произвести прямую артериальную инъекцию

выше места окклюзии. Этот доступ позволяет распределить генетический материал по коллатералям и достичь дистальных отделов, где неоваскуляризация была бы желательна. Системная интоксикация является потенциальным побочным эффектом при этом способе. Локальная доставка может быть достигнута прямой инъекцией протеинов ангиогенеза в мышцу, через которую проходят коллатеральные сосуды. Локальная инъекция заметно уменьшает возможность развития системной интоксикации, но ограничивает проявления белков ангиогенеза в тканях, в которые вводился ген [28, 29].

Возможные побочные эффекты

Систематическое применение стимуляторов ангиогенеза несет риск развития неоваскуляризации в тканях, не являющихся мишенями (таких как глаза или суставы). Поскольку опухолевый рост тоже зависит от ангиогенеза, систематическое введение факторов ангиогенеза несет также риск ускоренного развития скрытых опухолей. Истинный риск этих неблагоприятных событий неизвестен. К счастью, большинство нормальных тканей не проявляют заметной рецепторной активности к таким стимуляторам. Следовательно, можно предположить, что патологическая неоваскуляризация не произойдет, по крайней мере, до тех пор, пока ткани длительное время не будут подвергаться высокой концентрации экзогенно вводимых факторов ангиогенеза [30]. Однако необходима осведомленность о возможных побочных эффектах терапевтического ангиогенеза, и наступление этих явлений четко мониторировалось в клинических испытаниях.

Клинические испытания

Бесчисленными клиническими испытаниями на животных было установлено, что ангиогенные факторы роста обеспечивают развитие коллатеральных артерий и капилляров в условиях периферической или миокардиальной ишемии. Более того, постепенно накапливаются клинические испытания терапевтического ангиогенеза у человека при ишемии миокарда или нижних конечностей, в том числе несколько исследований идут сейчас полным ходом. Ниже приведены результаты завершившихся или продолжающихся клинических исследований, относящихся к кровообращению нижних конечностей.

Исследования VEGF

Baumgartner и соавторы в 1997 г. сообщили о результатах первой фазы клинических испытаний внутримышечного применения VEGF165 у 9 пациентов с критической ишемией нижних конечностей [31]. Большинство этих пациентов имели либо боли в покое, либо незаживающую язву, и проведение у них хирургического либо эндоваскулярного вмешательства было невозможно. Введение гена в дозе 2000 мкг освобожденной от плазмид ДНК, кодирующей VEGF165, осуществлялось через внутримышечную инъекцию в ишемизированную конечность. Инъекции проводились дважды с 4-недельным интервалом. Успешное функционирование гена у пациента подтверждалось увеличением уровня плазменного VEGF. Рентгеноконтрастная и ядерномагнитная ангиографии выполнялись до и через 4 недели после лечения, срок наблюдения за пациентами состав-