2 курс / Нормальная физиология / ТКАНЕВАЯ ТЕРАПИЯ. ПЛАЦЕНТА

Рис. 9. Экспрессия человеческими МСК нейрональных маркеров в периинфарктной зоне головного мозга крыс с ишемическим инсультом через 3 недели после трансплантации клеток. А – экспрессия человеческого GFAP; Б – экспрессия человеческого NeuN

Также в работе было установлено, что через 12 дней после внутривенного введения человеческих клеток крысам с ишемическим инсультом происходит активная стимуляция пролиферации резидентных нейрональных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне обоих полушарий. Используя маркер пролиферирующих клеток Ki-67, было показано, что по сравнению с контрольными животными количество делящихся клеток в субвентрикулярной зоне опытных животных становится существенно выше. Более того, Ki-67 позитивные клетки (т.е. пролиферирующие клетки) у опытных животных формируют отчетливые тангенциально направленные «треки», чего не наблюдается у контрольных крыс. Вдобавок, у экспериментальных животных, в отличие от контрольных, в очаге ишемии и вокруг него наблюдаются массивные скопления пролиферирующих клеток (рис. 10).

141

https://t.me/medicina_free

Рис. 10. Стимуляция пролиферации резидентных клеток СВЗ (окрашивание антителами к Ki-67). А – СВЗ контроль; Б – СВЗ опыт; В – путь миграции контроль; Г – путь миграции опыт; Д – периинфарктная зона контроль; Е – периинфарктная зона опыт.

Выводы

1.Разработан метод мечения МСК плаценты человека магнитными флуоресцентными микрочастицами, обеспечивающий 90 %-ную эффективность мечения и не влияющий на основные характеристики клеток в культуре – скорость пролиферации, способность к нейрогенной дифференцировке и жизнеспособность.

2.При интраспинальном введении животным с травмой спинного мозга меченые МСК активно мигрируют в спинном мозге в ростральном, каудальном и вентральном направлениях. Некоторое количество клеток обнаруживается в зубчатой извилине гиппокампа головного мозга.

3.При внутривенном введении меченых человеческих МСК крысам с экспериментальным ишемическим инсультом в течение первых суток после трансплантации они обнаруживаются во всех паренхиматозных органах. В течение 2 недель после трансплантации меченые МСК проникают в ткань головного мозга, формируют «треки» миграции, начинающиеся от кровеносных сосудов, и обнаруживаются

взоне ишемии и в гиппокампе.

142

https://t.me/medicina_free

4.Интраспинальная трансплантация МСК плаценты человека мышам с травмой спинного мозга способствует трехкратному улучшению локомоторной функции задних конечностей по шкале BMS.

5.В тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт» в опытной группе животных с ишемическим инсультом статистически достоверное улучшение показателей неврологического статуса (по сравнению с контрольными животными) происходит уже на 7-е сутки после операции, подобная тенденция сохраняется на протяжении всего эксперимента.

6.По данным МРТ, вследствие трансплантации человеческих МСК крысам с ишемией мозга размер очага ишемии существенно уменьшается к 7-м суткам, а через месяц у опытных животных объем очага поражения уже в 10 раз меньше, чем у контрольных животных.

7.Человеческие плацентарные МСК, трансплантированные мышам со спинальной травмой и крысам с экспериментальным ишемическим инсультом, в единичных случаях проявляют признаки неполной видоспецифичной нейрональной дифференцировки.

8.Положительные эффекты трансплантированных МСК связаны не с замещением погибших клеток реципиента трансплантированными клетками, а в большей степени с паракринной стимуляцией собственных репаративных процессов, в частности, с усилением миелинизации нервных проводников при спинальной травме и с активацией пролиферации эндогенных нейральных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне животных с экспериментальным ишемическим инсультом и их миграцией в очаг поражения.

Практические рекомендации

1.Количество магнитных флуоресцентных микрочастиц (Bangs laboratories, Inc., США), использующихся для мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека должно составлять не более 5 мкл стоковой суспензии на 1 мл культуральной среды.

2.Перед внутривенным введением животным человеческих плацентарных МСК клетки необходимо тщательно суспендировать,

адля инъекции использовать катетер с фильтром, во избежание окклюзии сосудов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Губский Л. В., Учеваткин А. А., Леденев В. В., Таирова Р. Т., Чеглаков И. Б., Цебоева А. А., Бурунова В. В., Ярыгин К. Н., Ярыгин В. Н.,

143

https://t.me/medicina_free

Скворцова В. И. Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, меченых микрочастицами оксида железа в декстрановой оболочке на экспериментальных моделях ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов 9 го международного семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 2008. Стр. 76–77.

2.Скворцова В. И., Ярыгин В. Н., Ярыгин К. Н., Пирогов А. Ю., Губский Л. В., Поварова О. В., Цебоева А. А., Таирова Р. Т. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». Москва, 2008. Стр. 90–91.

3.Ярыгин К. Н., Чеглаков И. Б., Кониева А. А., Бурунова В. В., Таирова Р. Т., Губский Л. В., Каралкин П. А., Лупатов А. Ю., Шрагина О. А., Черкезов Я. А. Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований в области клеточных технологий // Сб. материалов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2012 годы». Москва, 2008. Стр. 159.

4.Gubskiy L., Tairova R., Pirogov Yu. A., Ceboeva A. A., Burunova V. V., Yarygin K. N., Yarygin V. N., Skvortsova V. I. The influence of intravenous introduction mesenchymal stem cells marked by ultra small particles of iron oxide at infarct in rats И International Journal of Stroke. 2008. Vol. 3, suppl.

1.6th World Stroke Congress, Vienna, Austria: Abstract PO0I-297.

5.Yarygin K. N., Kholodenko I. V., Korneva A. A., Burunova V. V., Tairova R. T., Gubsky L. V., Pirogov Yu. A., Yarygin V. N., Skvortsova V. I. Mechanisms of beneficial effects of human placenta MSC transplantation in rats with experimental ischemic stroke // Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe conference. Edinburgh, 2009. P. 276.

6.Ярыгин K. H., Холоденко И. В., Кониева A. A., Бурунова В. В., Таирова Р. Т., Губский Л. В., Чеглаков И. Б., Пирогов Ю. А., Ярыгин В. Н., Скворцова В. И. Механизмы положительного влияния трансплантации МСК плаценты человека на восстановление крыс после экспериментального ишемического инсульта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009, т. 148, № 12, С. 699–702.

7.Скворцова В. И., Ярыгин В. Н., Пирогов Ю. А., Ярыгин К. Н., Губский Л. В.,Таирова Р. Т.,Холоденко И. В.,Кониева А. А.,Бурунова В. В. Хо- уминг-эффект мезенхимальных стволовых клеток на модели острой фокальной ишемии мозга у крыс // Сб. материалов Российской науч- но-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение». Пятигорск, 2010. Стр. 41.

144

https://t.me/medicina_free

Д.В. ПАХОМОВ

Фармакологическая коррекция препаратом плацентарных гликозаминогликанов

ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона

14.00.25 – Фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Уфа 1997

145

https://t.me/medicina_free

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

С.А. Башкатов, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Научный консультант:

Ю.А. Медведев, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Д.Н. Лазарева, лауреат Государственной премии РФ, заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор

В.А. Стригин, доктор медицинских наук, профессор

Ведущее учреждение – Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоялась 30.10.1997 на заседании диссертационного совета Д 084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета по адресу: г. Уфа, ул. Ленина, 3.

146

https://t.me/medicina_free

Введение

Актуальность проблемы. Цитостатическая и иммуносупрессивная терапия, важными средствами которой являются циклофосфан

ипреднизолон, широко применяется в клинике при лечении больных с онкопатологией, аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, после трансплантационных вмешательств и т.п. Многочисленные осложнения этой терапии, в числе которых можно отметить нарушения гемопоэза и функциональной активности разных видов клеток крови, порождают необходимость применения медикаментозных средств для их коррекции. Несмотря на разнообразие применяющихся с этой целью подходов и препаратов, данная проблема сохраняет свою актуальность.

Впоследние годы получены данные о значимой роли в регуляции

иподдержании процессов гемопоэза гликозаминогликуронанов (ГАГ), являющихся одним из классов гетерополисахаридов и широко представленных в клетках и тканях организма (Гольдберг Е. Д. и др., 1995.).

Вряде исследований (Бельский М. С., 1993) показана возможность использования экзогенных ГАГ (гепарин и др.) в качестве корректоров нарушенных процессов гемопоэза. Однако практическое использование этих препаратов затруднено вследствие недостаточной информации о характере изменений метаболизма ГАГ при действии повреждающих факторов на гемопоэз.

Цель работы: обоснование возможности использования препарата гликозаминогликуронанов плаценты человека в качестве корректора ряда побочных эффектов цитостатиков и иммуносупрессоров.

Задачи исследования:

1.Исследовать влияние препарата гликозаминогликуронанов плаценты человека на уровень конечных продуктов ПОЛ, обмен ГАГ, гематологические, эндокринные показатели в тканях кроветворных органов интактного организма.

2.Изучить влияние преднизолона и циклофосфана на содержание конечных продуктов ПОЛ, ГАГ, уроновых кислот в периферической крови и кроветворных органах.

3.Оценить в эксперименте возможность применения препарата гликозаминогликуронанов плаценты человека в качестве корректора ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона.

4.Обосновать перспективность использования препарата гликозаминогликуронанов плаценты человека в клинике для устранения нарушений уровня ПОЛ, ГАГ, эндокринного статуса, вызванных преднизолоном и циклофосфаном.

Научная новизна. Проведенные исследования показали существенную роль дестабилизации обмена гликозаминогликанов в механизмах побочных эффектов циклофосфана и преднизолона на систе-

147

https://t.me/medicina_free

му кроветворения. Впервые показана возможность коррекции ряда побочных эффектов этих соединений препаратами ГАГ.

Практическая значимость. Результаты исследований демонстрируют возможность прогнозирования клинического течения гематологических заболеваний по выявленной зависимости между снижением уровня ГАГ и депрессией гемопоэза, позволяют обосновать перспективность дальнейших исследований сочетанного применения цитостатиков и иммуносупрессоров с препаратом гликозаминогликуронанов, в результате которого может быть уменьшено побочное действие этих фармакологических средств.

Теоретические аспекты работы включены в преподавание курсов фармакологии, иммунологии и неврологии в Башкирском государственном медицинском университете.

Положения, выносимые на защиту:

1. В побочных эффектах терапевтических доз циклофосфана и преднизолона существенное значение имеют нарушения обмена ГАГ, интенсивности процессов перекисного окисления липидов и состояния биомембран в организме.

2.Препарат гликозаминогликуронанов плаценты человека следует рассматривать в качестве перспективного средства коррекции ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона.

3.Уровень эндогенных ГАГ в органах и тканях гемопоэза косвенно характеризует функциональное состояние кроветворения в организме.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 1995, 1996), заседаниях общества фармакологов Башкортостана (Уфа, 1995, 1997), на Международном симпозиуме «Экология-95» (Уфа, 1995), на научной конференции БГМУ «Проблемы теоретической медицины» (Уфа, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 171 странице машинописи, содержит 21 таблицу и 30 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 234 источника, из которых 119 отечественных и 115 зарубежных

авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментывыполненына 1300белыхнеинбредныхполовозрелых крысах-самцах, 600 белых неинбредных мышах и 200 мышах ли-

148

https://t.me/medicina_free

нии СВА, полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово».

В работе использовали препарат плацентарных гликозаминогликанов (ПГАГ) чистотой 95,5 %, выделенный из плаценты человека.

Преднизолон (Пр) вводили в дозах 5 и 0,1 мг / кг подкожно 1 раз в сутки в течение 3 дней. При этом первая доза моделировала среднетерапевтическое, а вторая – заместительное воздействие (Сергеев П. В. и др., 1996). Циклофосфан (Цф) вводили в среднетерапевтической дозе 8 мг / кг по схеме, аналогичной таковой для преднизолона. Животныеподопытныхгруппчерез30минутпослевведенияпреднизолона или циклофосфана получали внутрибрюшинно ПГАГ (по 10 мг / кг) или гепарин (по 50 ЕД / кг), который использовали в качестве препарата сравнения. Забор крови при изучении гематологических показателей, определении уровня конечных продуктов ПОЛ (малонового диальдегида (МДА)) (Стальная И. Д., Гаришвили, 1977), содержания ГАГ и уроновых кислот (УК) (Шараев П. Н. и др., 1989), кортизола, ТЗ и Т4 осуществляли на 1, 3, 6, 12, 24 ч и на 3, 6, 10, 14, 17 и 21-е сутки эксперимента. Для изучения гистологических показателей забор образцов осуществляли на 6-е и 21-е сутки опыта. Выделение ядерной, лизосомальной, микросомальной и цитозольной фракций проводилось с помощью стандартных методик (Финдлей Дж., 1990).

Морфо-функциональные показатели периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов; содержание гемоглобина, лейкоцитарная формула) изучали рутинными методами. При подсчете форменных элементов обращали внимание на наличие деструктивных форм меток, изменение их размеров и качественные модификации микроокружения. ГАГ в костном мозге и селезенке определяли по Hronowski S. J. et al. (1986). Резистентность эритроцитов к гемолитическому действию соляной кислоты определяли методом кислотных эритрограмм (Терсков И. А. и др., 1957). Влияние ПГАГ на спонтанную и индуцированную митогенами пролиферативную активность иммуноцитов оценивали в культурах клеток селезенки интактных и иммунизированных мышей линии СВА. О пролиферации культур судили по включению в ДНК клеток радиоактивной метки ³Н-тимидина (Фримель Г., 1987). ГЗТ к ДНХБ изучалась на модели оте-

ка ушных раковин (Orzybilla В. et al., 1983).

Математическую обработку результатов исследования проводили на ПЭВМ IBM 486 DX5 с применением программного обеспечения

Microsoft Excel.

На рисунках звездочкой (*) обозначены статистически достоверные различия с контрольной группой.

149

https://t.me/medicina_free

Результаты работы

Выполненные нами эксперименты показали, что парентеральное введение препарата плацентарных гликозаминогликуронанов значительно увеличивает содержание эндогенных ГАГ в гемопоэтических органах и тканях подопытных животных (рис. 1). Проведенные параллельно микроскопические исследования констатировали появление гликозаминогликанов в ядрах и цитоплазме стромальных клеточных элементов (клетки-предшественники, а также дифференцирующиеся фибро- и остеобласты) и только вслед за этим обогащение ими межклеточного матрикса, свидетельствующее об усилении синтеза именно эндогенных гликозаминогликанов (рис. 2).

Введение ПГАГ усиливало костномозговое кроветворение в целом, затрагивая все стадии дифференцировки клеток-предшественни- ков кроветворения (особенно эритропоэза), и протекало на фоне усиленной пролиферации клеточных элементов стромы костного мозга при значительном возрастании объема микроциркуляции.

Препарат сравнения гепарин вызывал меньшую активацию кроветворения и не оказывал существенного влияния на стромальные элементы костного мозга. В селезенке при введении ПГАГ (но не гепарина) отмечалось некоторое уменьшение Т-зависимой зоны (Т-зоны) лимфоидных фолликулов при значительном увеличении Т-независимой зоны (В-зоны), свидетельствующее о стимуляции дифференциации В-звена иммунной системы. Эти данные подтверждаются результатами РБТЛ (комитогенный эффект ПГАГ на пролиферацию, индуцированную В-митогеном) и ГЗТ к ДНХБ (угнетение ПГАГ интенсивности реакций контактной аллергии).

Применение изучаемого полисахаридного препарата приводило к быстрому увеличению количества лейкоцитов, ретикулоцитов и гемоглобина в периферической крови подопытных крыс, которое сопровождалось постепенным нарастанием содержания эритроцитов и тромбоцитов, молодых форм нейтрофилов при относительном уменьшении присутствия эозинофилов и базофилов. К окончанию эксперимента сдвиги в лейкоформуле исчезали. Фармакологические эффекты препарата сравнения (гепарин) совпадали по направленности с последними ПГАГ, но были менее выраженными.

Изучение системы периферического эритрона (рис. 3) при введении ПГАГ выявило появление чрезвычайно устойчивых к гемолизу форм эритроцитов, не присутствующих в эритрограммах интактных животных,пулкоторыхв течениеэкспериментапродолжалнарастать. Использование гепарина вызывало только две волны выброса молодых форм на 6-е и 17-е сутки опыта, что подтверждает литературные данные о наличии у гепарина гемостимулирующих свойств (Бель-

ский М. С., 1993).

150

https://t.me/medicina_free