2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Серов_В_В_,_Апросина_З_Г_Хронический_вирусный_гепатит2
.pdfХронический вирусный гепатит
Канцерогенез - многостадийный процесс, в котором взаимо действуют вирус и организм хозяина и конечным результатом которого является перестройка ДНК гепатоцитов. Риск разви тия ГЦК увеличивается по мере прогрессирования хроническо го гепатита В, что связано с нарастающей длительностью персистенции HBV-инфекции и стойкостью или рецидивами некровоспалительного процесса в печени. Некоторые другие факторы окружающей среды, в частности алкоголизм, могут оказывать синергический эффект и ускорять развитие ГЦК.
Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что чем больше продолжительность HBV-инфекции и выраженность заболевания печени, тем выше вероятность инфицированных гепатоцитов подвергнуться злокачественной трансформации. По данным тайваньских исследователей, риск ГЦК на 100 тыс. населения в год составил: в общей популяции на Тайване от 10 до 30 случаев; среди больных хроническим гепатитом В (HBs Ag+) - от 200 до 812 случаев [Chen C.Y. et al., 1997; Di Bisceglie A.M., 1998]; при прогрессировании до цирроза печени - от 1000 до 5000 случаев, что составляет 1-5% [Tsukuma Н. et al., 1993].
Как указывалось, при гепатите В вирус интегрируется в хромосомальную ДНК хозяина, однако молекулярный механизм канце рогенного эффекта HBV остается недостаточно изученным. Инте грация сопровождается хромосомными делениями и транслокациями, влияющими на рост и дифференцировку клеток (инсерционный мутагенез). Однако делеции не соответствуют участкам встраива ния вирусной ДНК, а в 15% случаев рака последовательности в опухолевой ткани не обнаруживаются [Kurai К. et al., 1989].
Недавно был обнаружен ген p-catenin, мутирующий в 26% случаев ГЦК человека [La Coste A. et al., 1998]. Такие мутации предотвращают деградацию (З-catenin’a, который продолжает по сылать пролиферативный сигнал клеткам, возможно, через акти вацию С -rnyc гена [Не Т.С. et al., 1998].
Интеграция HBV ДНК приводит к транслокации генов-супрес соров опухоли на хромосоме 17, однако лишь немногие из этих генов мутируют с высокой частотой в ГЦК [Tabor Е., 1994]. Даже мутации хорошо известного гена р53 имеют место только в 20-50% случаев [Tabor Е., 1994]. Кроме того, р53 часто мути рует при многих солидных опухолях и, следовательно, его му тации не являются уникальными для ГЦК.
Характер интеграции HBV ДНК в геном клеток хозяина не постоянен. и вирусный геном у разных больных может инте58
Патогенез хронической инфекции
грироваться в различные участки ДН К опухолевых клеток. Ряд продуктов генов HBV, в частности структурные протеины (ядро, оболочка, полимераза), не рассматриваются как способные к прямой трансформации гепатоцитов [Chen P.Y., Chen D.S., 1 9 9 9 ]. В настоящее время HBV Х-антиген (НВх) считается наи более интегрирующим продуктом вируса, вовлеченным в пря мую трансформацию клеток. НВх является активатором транс крипции и ингибитором протеазы.
Недавно к этому полипотентному протеину было привлече но внимание в связи с его способностью влиять на клеточный апоптоз или антиапоптоз - процессы, существенные для смерти или "выздоровления" клетки. НВх антиген ингибирует caspase 3 (общий эффектор для апоптоза) и таким образом предотвра щает клеточный апоптоз [Gottlob К. et al., 1998]. В то же время имеются указания на то, что НВх антиген сенсибилизирует клетки к апоптозу [Kim Н. et al., 1998]. Противоречивость этих данных объясняют зависимостью эффекта НВх на апоптоз от типа клеток и других генетических факторов, таких как р53 статус, или внешних стимулов.
Считают, что онкогенный потенциал HBV играет роль "одного шага" в последовательности множественных мутаций, которые ведут к ГЦК. Наоборот, хроническое воспаление, обусловлен ное иммунным ответом, и его потенциальное значение в раз витии карциномы печени получили постепенное признание.
У человека существуют трудности отграничения вирусных факторов от факторов хозяина, разрешить которые удалось на мо дели HBV-T2 мышей. На этой модели было показано, что сам по себе HBV, продуцирующий вирионы, не ведет к цитотоксичности и не является стимулом развития ГЦК. При восстановлении у этих мышей HBV-специфического иммунного ответа развивался хронический гепатит и позднее - ГЦК; при этом отмечено, что Для создания последней модели не требовались как интеграция HBV, так и трансактивация [Nakamato Y. et al., 1998].
Таким образом, эксперименты на животных отчетливо пока зали значение иммуноопосредованного повреждения, которое является необходимым и достаточным для развития ГЦК. Хро нический гепатит В, длительно персистирующий и обостряю щийся, рассматривается как центральное звено в канцерогенеЗе [Chen P.Y., Chen D.S., 1999].
Гибель HBV-инфицированных гепатоцитов сопровождается
Регенерацией, что необходимо для поддержания функций
59
Хронический вирусный гепатит
печени. Иммунные повреждения гепатоцитов через поврежде ние ДНК, индуцированное цитотоксинами [Lazutka Z.R., 1996] или путем генерации окислительных свободных радикалов, ко торые модифицируют геном химически [Hagen Т.М. et al., 1994], ведут к мутациям. Поврежденные клетки стимулируют к росту также цитокины (ИЛ-6 или фактор роста гепатоцитов). Они пролиферируют в течение более длительного времени, чем неинфицированные гепатоциты. Повышенное количество циклов репликации не только обусловливает более высокий шанс ее ошибки, но и передает предшествующие мутации следующим гепатоцитам.
Как видно, у больных персистирующим хроническим гепа титом В в течение 20-30 лет пропорция инфицированных гепа тоцитов, содержащих аккумулированные генетические мутации, постепенно нарастает, и вместе с ней нарастает риск развития ГЦК.
При длительном течении хронического гепатита В одни ге патоциты погибают, а другие выживают и регенерируют, ста новятся гиперпластическими и формируют "регенеративные узлы" [С1ш С.М. et al., 1995]. Происходит это благодаря тому, что гепатоциты сохраняют важные свойства, которые могут стимулировать клеточный рост и сопротивляться гибели клетки (антиапоптоз). После десятилетней персистенции гепатита не которые из выживших регенерирующих гепатоцитов накапли вают еще больше мутаций (приобретенное свойство автономного роста) и начинают клональную экспансию, что сопровождается нарастанием цирротических узлов в печени [Chen P.Z., Chen D.S., 1999]. В печени при далеко зашедшем циррозе содержится множество диспластических моноклональных узлов; таким образом, она является ареной для развития ГЦК.
Обращается внимание на то, что персистенция гепатита в комбинации с реактивной гиперплазией гепатоцитов характерна не только для HBV, но и для хронического гепатита С. Клини ко-морфологические исследования показали, что при HBVиндуцированной ГЦК у 20-50% больных нет сопутствующего цирроза печени [Shiratoni Y. et al., 1995]. В то же время HCVиндуцированная ГЦК почти всегда развивается на фоне цирро за печени [Chang М.Н. et al., 1989]. Приведенные факты свиде тельствуют о специфической роли HBV в развитии ГЦК у нецирротических больных и являются основанием для дальней ших исследований [Chen P.Z., Chen D.S., 1999].
60
Патогенез хронической инфекции
Таким образом, при далеко зашедшей стадии хронического гепатита В риск развития ГЦК нарастает, что является след ствием накопления многостадийных хромосомных мутаций в поврежденных гепатоцитах. Персистенция хронического гепа тита В индуцирует эти мутации путем иммуноопосредованного повреждения гепатоцитов и последующей их гиперплазии.
3.2. ПАТОГЕНЕЗ ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИИ
Патогенез ХГ-С изучен недостаточно. Как при любой дру гой инфекции, течение и исход инфекции HCV (элиминация или персистенция вируса), наличие и выраженность поражения печени, других органов и систем определяются взаимоотноше нием факторов вируса (таких как количество инфицировавшего материала, спектр инфицируемых клеток, активность реплика ции и способность вируса к мутациям, выраженность прямого цитопатического эффекта вируса) и факторов хозяина. В дан ной главе рассматриваются основные факторы вируса, в част ности, возможность его репликации вне печени; особенности иммунного ответа на HCV; механизмы персистенции HCV в организме хозяина; механизмы поражения печени и внепеченочных поражений.
Репликация HCV в печени и вне ее. Обязательным условием развития инфекции HCV, относящегося к гепатотропным ви русам, является его проникновение в гепатоциты. Именно в гепатоцитах происходит в основном репликация HCV, что по казано с помощью иммуногистохимических и молекулярно биологических (in situ гибридизация, in situ полимеразная цепная реакция в варианте с обратной транскрипцией) методов. В по следние годы получена возможность судить об объеме инфициро ванных гепатоцитов и уровне репликации в них, сопоставлять уровень репликации с уровнем виремии и клинико-морфологиче скими данными, определять локализацию вируса на субклеточ ном уровне. В то же время возможность репликации HCV вне печени оставалась предметом дискуссий.
С первых лет изучения HCV предполагалось, что он, подоб но Другим представителям семейства Flaviviridae, может инфи цировать широкий спектр клеток. Однако получение доказа тельств репликации HCV вне печени связано с определенными трудностями. Обнаружения позитивных цепей РНК в различ-
органах и тканях, показанного в большом количестве исДований, недостаточно для доказательства репликации в них
61
Хронический вирусный гепатит
HCV, так как оно может отражать контаминацию кровью, ад гезию вирионов на поверхности мононуклеарных клеток крови. Для подтверждения репликации в тех или иных клетках орга низма необходимо обнаружение в них репликативных минусцепей РНК или неструктурных белков HCV иммуногистохими чески. Экспериментальные трудности в изучении внепеченочной репликации обусловлены крайне низким ее уровнем, тре бующим применения высокочувствительных методов, и высо ким риском ложноположительных результатов, т. е. низкой специфичностью стандартного метода ПЦР для выявления (-)РНК в тканях. Это наряду с противоречивыми результатами in situ гибридизации явилось причиной неоднократного пере смотра и оспаривания результатов ранних исследований ре пликации HCV в мононуклеарных клетках крови. В последние годы разработаны различные модификации ПЦР, в частности с использованием меченых праймеров, химической модифика ции З'-концов РНК перед обратной транскрипцией, тсрмостабильной обратной транскриптазы и др., что повысило се спе цифичность в обнаружении (-)РНК.
В большинстве исследований, в которых использовались высокоспецифичные модификации ПЦР, а также в ряде иссле дований с применением метода in situ гибридизации (-)РНК была выявлена в мононуклеарных клетках крови (моноцитах/ макрофагах, В-лимфоцитах и полиморфно-ядерных лейкоци тах) у 8-40% обследуемых больных ХГ-С [Negro F., 1998; Lerat Н. et al., 1998; Crovatto M. et al., 2000]. Предполагается, что от рицательные результаты ряда работ могут быть обусловлены снижением чувствительности методов с повышением их спе цифичности, низким уровнем репликации, имеющей место лишь в части (по результатам различных исследований, от 0,15 % до 8,1%) мононуклеарных клеток крови, и возможной зависи мостью ее от длительности инфекции и генотипа HCV [Negro F., 1998]. Доказательством возможности репликации HCV в мононуклеарных клетках крови служит также способность HCVинфекции к персистированию в них, продемонстрированная в исследовании на специально созданной модели животных [Bronowicki J.P. et al., 1998].
Несмотря на разноречивые результаты исследований воз можности репликации HCV в клетках костного мозга и высокую вероятность контаминации препаратов костного мозга перифе- рийными клетками, следует отметить ряд работ, в которых 62
Патогенез хронической инфекции
/ )рН К обнаруживалась в клетках костного мозга с помощью высокоспецифичных модификаций ПЦР [Radkowski М. et al.,
2000], |
(+) и |
(-)Р Н К |
и антигены |
HCV внутри |
клеток костного |
мозга |
(в том |
числе |
в клетках-предш ественниках гемопоэза - |
||
CD34+) при |
применении in situ |
гибридизации |
(а также in situ |
||
П Ц Р ) и иммунофлюоресценции соответственно [Sansonno D. et al 1998]. Получены также экспериментальные данные в пользу возможности репликации HCV в мегакариобластах [Li X. et al.,
1999].
Имеются пока единичные работы, свидетельствующие о возможности репликации HCV в других (помимо печени и мо нонуклеарных клеток крови) органах и тканях. Представляет интерес обнаружение (-)РН К в аутопсийном материале (лим фатических узлах, поджелудочной железе, надпочечниках, щ и товидной железе, селезенке и костном мозге) умерших больных синдромом приобретенного иммунодефицита, сочетающегося с HCV-инфекцией [Laskus Т. et al., 1998]; в слизистой оболочки полости рта, пораженной красным плоским лишаем, карцино мой (полимеразная цепная реакция) [Nagao Y. et al., 2000], в эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта (in situ гибридизация) иммунокомпетентных больных с HCV-инфекцией и красным плоским лишаем [Arietta J.J. et al., 2000]. В недавнем исследовании, проведенном в Китае, неструктурные белки HCV иммуногистохимически в цитоплазме клеток и (-)РН К (поли меразная цепная реакция) были обнаружены в различных тка нях (почки, сердце, поджелудочная железа и кишечник) боль ных ХГ-С [Yan F. et al., 2000].
Представляют интерес результаты ряда исследований, пока завших различия последовательностей в участках Е2 геномов HCV, выделяемых из ткани печени, мононуклеарных клеток крови и других тканей одного и того же больного. Эти резуль таты позволяют предполагать наличие независимо реплици рующихся популяций вируса в организме хозяина и связь эво люции квазивидов с тканевым тропизмом вируса, подобную т°и, которая доказана, например, для вируса иммунодефицита человека и для представителей семейства Flaviviridae (так, за мена единственной аминокислоты в молекуле белка оболочки вирусов этого семейства ведет к изменению клеточного тро-
и вирулентности) [Laskus Т. et al., 2000]. Известно, что внедрения вирусного материала в клетку вирусы используют
Цифические рецепторы на наружной клеточной мембране.
63
Хронический вирусный гепатит
В недавних исследованиях на поверхности некоторых типов клеток (гепатоцитов, лимфоцитов) идентифицирован предпола гаемый рецептор (или корецептор) для Е2 HCV - клеточный протеин CD81 [Pileri P. et al., 1998]. Возможно, в ходе инфек ционного процесса расширяется круг используемых вирусом корецепторов и в инфекционный процесс вовлекаются новые ткани организма. По-видимому, в ближайшие годы будут рас шифрованы как антигенные детерминанты тканевого тропизма HCV в оболочечном белке Е2, так и рецепторы и корецепторы для HCV в различных типах клеток.
Иммунный ответ на HCV-инфекцию. Инициальный ответ на инфекцию HCV характеризуется мобилизацией неспецифической иммунной защиты: интерфероны, естественные киллеры. Но уже через несколько дней после инфицирования развивается спе цифический иммунный ответ, который направлен как на эли минацию свободных вирусных частиц и защиту от повторного инфицирования (осуществляется преимущественно гуморальным звеном иммунного ответа), так и элиминацию вируса, проник шего в клетки, путем лизиса инфицированных клеток и путем ингибирования репликации вируса цитокинами без лизиса кле ток (осуществляется клеточным звеном иммунного ответа). Ис следования показали, что HCV-инфекция у иммунокомпетентных лиц сопровождается гуморальным и клеточным вирусспецифическим иммунным ответом, который, однако, у большинства инфицированных не приводит к элиминации вируса и не защи щает от реинфекции. До настоящего времени не установлены все факторы вируса и хозяина, обусловливающие неспособность иммунного ответа контролировать эту инфекцию. Особое внима ние уделяется изучению особенностей иммунного ответа у лиц с саморазрешающейся острой HCV-инфекцией, так как это может дать ключ к решению проблемы лечения и профилактики.
HCV-специфический гуморальный иммунный ответ характе ризуется образованием антител, направленных против струк турных и неструктурных антигенов H C V . В отличие от H BV - инфекции, при инфекции H C V не наблюдается специф ического антительного ответа, являющегося протективным.
возможность повторного инфицирования шимпа1$зе и человека H C V , причем не только иными, но и гомологичными штамма ми. Тем не менее в экспериментальных исследованиях у ст а н о влено образование специфических антител, способных нейтрализовывать соответствующий изолят H C V in vitro и in vivo, а 64
Патогенез хронической инфекции
акж е антител, способных ингибировать связывание оболочеч- Т го белка Е2 с гепатоцитами in vitro [Shimizu Y.K. et al., 1994;
Ishii K. et al., 199b].
Мишенью нейтрализующих антител оказались белки оболочки Е1 и Е2, преимущественно HVR1. Высокая гетерогенность этого белка между различными изолятами и чрезвычайная изменчи вость течения инфекции у одного и того же больного обуслов ливают неэффективность гуморального звена иммунного ответа (и трудности создания вакцин), так как нейтрализующее дей ствие постоянно продуцируемых изолятспецифических антител
оказывается ограниченным во времени [Weiner A. et al., |
1992; |
S h im iz u Y.K. et al., 1994]. Показанный значительно более |
низ |
кий уровень мутаций в HVR1 HCV у больных с гипогаммаглобулинемией предполагает роль иммунного давления в развитии мутаций и подтверждает гипотезу о роли иммунной селекции в эволюции мутантов HCV, способных избегать иммунного отве та хозяина.
При анализе титров и времени появления различных HCVспецнфических антител на протяжении HCV-инфекции (у лиц, инфицированных одним и тем же изолятом HCV) выявлено значимо более раннее появление антител к HVR1 при острой саморазреш ающ ейся инфекции по сравнению с хронизирующейся, в то время как не было различий в появлении и титрах других HCV-специфических антител [Zibeit A. et al., 1997]. П о казана возможность саморазрешения HCV-инфекции при на личии длительно высоких титров ингибирующих связывание Е2 антител [Ishii К. et al., 1998]. Работы по созданию рекомби нантных фрагментов антител, обладающих перекрестной актив ностью в отношении ингибирования связывания белков Е2 раз личных изолятов HCV, представляют одно из направлений в разработке вакцин.
HCV-специфический клеточный иммунный ответ. Поскольку ^CV, как и другие вирусы, является внутриклеточным парази том, наибольшее значение в защите организма хозяина имеет клеточный вирусспецифический иммунный ответ. При HCVинфекции он, как и гуморальный, носит поликлональный и мультиспецифический характер.
Ключевую роль в иммунопатогенезе ХГ-С отводят недоста точности и качественным особенностям CD 4+ Т-хелперного ответа на ранних этапах инфекции. Как известно, для актива- НИИ CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов необходимо распознавание
Хронический вирусный гепатит
ими с помощью антигенсвязывающих рецепторов антигенов вируса, представленных молекулами главного комплекса гисто совместимости человека HLA/II класса на поверхности антигенпрезентирующих клеток (макрофагов, дендритических кле ток, В-лимфоцитов). Т-хелперы 1-го типа являются стимулятора ми клеточного ответа и секретируют провоспалительные цитокины (интерферон-у, интерлейкин 2, фактор некроза опухоли а и [■)). Эти цитокины усиливают цитотоксические реакции, опо средованные Т-лимфоцитами, могут обладать прямым цитотоксическим действием на трансформированные клетки либо индуцировать цитотоксичность у нормальных макрофагов. Т-хелперы 2-го типа являются стимуляторами гуморального ответа и продуцируют рад интерлейкинов, в том числе интер лейкин 4 и интерлейкин 10, оказывающих противовоспали тельное действие преимущественно за счет подавления дей ствия интерферона-у. Количественная и качественная оценка активности HCV-специфического Т-хелперного клеточного от вета (проводившаяся в большинстве исследований путем ана лиза Т-лимфоцитов-хелперов только периферической крови) у лиц с различным исходом О ВГ-С показала, что выраженность (СБ4+)-Т-клеточного ответа к антигенам HCV в целом и более активный ответ к КБЗ-белку, а также преимущественная про дукция Т-хелперов 1-го типа коррелируют с саморазрешением
инф екции . При хронизации |
ОВГ-С наблю дается слабый |
(С 04+)-Т -клеточны й ответ и |
обратное соотнош ение числа |
Т-хелперов (преобладание количества Т-хелперов 2-го типа) и продуцируемых ими цитокинов [Missale G. et al., 1996; Tsai S.L. et al., 1997; Pape G.R. et al., 1999].
Данные о Т-клеточном ответе, полученные при изучении иммунных клеток периферической крови in vitro, могут лишь частично отражать иммунные с о б ы т и я в ткани печени, являю щейся, по-видимому, местом преимущественного присутствия
Т-клеток в острой фазе инфекции. Тем не менее и м е ю щ а я с я
информация о более активном (СБ4+)-Т-хелперном, а также C D 8+ цитотоксическом иммунном ответе при саморазрешающемся ОВГ-С делает обоснованным раннее применение те рапии, направленной на активизацию и модификацию иммун ного ответа. В частности, раннее применение и н т е р ф е р о н а -о с оказалось высокоэффективным при ОВГ-С* Р а зр а б а т ы в а ю т ся и испытываются новые препараты, обладающие иммуномодУ' лирующими свойствами. Представляет интерес расшифровка
66
Патогенез хронической инфекции
иммунодоминантного эпитопа в NS3, локализованного в участке с аминокислотными остатками 1248-1261, что имеет практическое значение в создании пептидных лечебных вакцин [Pape G.R. et al.,
1999].
При саморазрешившейся острой HCV-инфекции вирусспецифические CD4+ Т-лимфоциты-хелперы и цитотоксические CD 8+ Т-лимфоциты, подобно тому, как это было показано при инфекции HBV, продолжают длительное время обнаруживаться в периферической крови (даже после исчезновения анти-HCV). Характеристика этого HCV-специфического Т-клеточного от вета, поддерживаемого Т-хелперами 1-го типа, позволяет пред полагать, что клиническое и вирусологическое саморазрешение HCV-инфекции, по-видимому, не означает полной эрадикации вируса, персистенция которого в минимальных количествах сохраняется под контролем иммунного ответа [Ferrari С. et al., 1999; Pape D.R. et al., 1999].
Исследования HCV-специфического CD4+ Т-хелперного отве та в периферической крови больных с хронической HCVинфекцией в различных стадиях выявили прямую зависимость его активности от длительности течения инфекции, а также преобладание CD4+ Т-хелперов, распознающих core и NS4 ан тигены [Botarelli P. et al., 1993; Ferrari С. et al., 1999]. Высокая иммуногснность core и NS4 антигенов подтверждена обнару жением coie- и ^4 -сп ец и ф и чески х CD4+ Т-хелперов в ткани печени. Представляют интерес данные о внутрипеченочной компартментализации Т-лимфоцитов - концентрации в ткани печени определенных клонов ^ 4 -сп ец и ф и ч еск и х (C D 4+)T - хелперов [Munutello М.А. et al., 1993]. При хронической HCVинфекции выявляется превалирование цитокинов, секретируе-
мых Т-хелперами 1-го типа, над цитокинами, |
секретируемыми |
Т-хелперами 2-го типа [Napoli J. et al., 1996], |
а также, как пра |
вило, активный CD8+ цитотоксический ответ (хотя и менее |
|
активный, чем при саморазрешающейся HCV-инфекции). HCV- |
|
специфические цитотоксические Т-лимфоциты при хронической ^ V-инфекции обнаруживаются преимущественно в ткани пече ни - месте основной локализации инфицированных HCV кле- т°к. Они распознают множество эпитопов структурных и не структурных белков вируса (к настоящему времени обнаружено лее 20 эпитопов-мишеней цитотоксических Т-лимфоцитов),
унтацию которых осуществляют молекулы HLA I класса.
v°диого и того же больного HCV-специфический (CD8+)T-
67