2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Серов_В_В_,_Апросина_З_Г_Хронический_вирусный_гепатит2

Хронический вирусный гепатит

шинство вирусов, резистентных к фамцикловиру, обнаруживается у "иммуноскомпрометированных" больных, но наблюдается и у иммунокомпетентного хозяина при длительном лечении этим препаратом.

2.2. ВИРУС ГЕПАТИТА D

HDV - сферическая частица со средним диаметром 36 нм, состоящая из ядра (HD Ag) и внешней оболочки, образованной поверхностным антигеном вируса В.

Геном HDV представлен однонитевой, циклической моле­ кулой РНК, состоящей приблизительно из 1700 нуклеотидов. Характер плотной упаковки генома определяется высокой сте­ пенью комплементарности нуклеотидов, входящих в его состав. В геноме имеется несколько открытых рамок считывания, как на геномных, так и на антигеномных нитях РНК. В РНК зако­ дирован вирусспецифический полипептид - HD Ag (пятая от­ крытая рамка считывания, локализованная на комплементар­ ной зоне РНК HDV). D-антиген локализуется в ядрах инфици­ рованных гепатоцитов, в ядрышках и/или нуклеоплазме, имеет выраженную РНК-связывающую активность.

HDV является дефектным вирусом, который для своей экс­ прессии, репликации и индукции гепатита требует вспомога­ тельной функции HBV. Развитие HDV-инфекции возможно только при одновременной репликации HBV. Этот факт опре­ деляет две формы их взаимодейстия: одновременного инфици­ рования HBV и HDV - коинфекция и инфицирования HDVносителя вируса гепатита В - суперинфекция. Характер взаимо­ связи этих вирусов определяется не только использованием HBs Ag для формирования внешней оболочки HDV, но и дру­ гими, до конца не расшифрованными взаимодействиями. Так, HDV ингибирует репликацию HBV, что ведет к уменьшению экспрессии НВе Ag и HBs Ag и угнетению активности ДНКполимеразы в течение острой инфекции. Одним из возможных объяснений этого факта служат данные о стимуляции HDV внутриклеточного синтеза интерферона, который ингибирует репликацию HBV.

В сыворотке крови D-антиген определяют при помощи иммуноферментного или радиоиммунного анализа (после обработки исследуемого материала неионными детергентами). Для обнару­ жения D-антигена в ткани печени (биопсия, аутопсия) применяют метод флюоресцирующих антител и иммунопероксидазный метод.

28

Вирусы хронического гепатита

В патогенезе гепатита D основное значение придается цитопатическим механизмам, в противоположность иммуноопосредованному поражению печени при HBV-инфекции. Однако в последние годы это положение подвергается пересмотру. Уста­ новлено, что в отсутствие иммунного ответа HDV-инфекция не проявляет значительного цитопатического эффекта [Gowans F.Y., Bonino F., 1993; Bichko V. et al., 1994J, и даже при наличии им­ мунного ответа хозяина она может быть скорее вспомогательной вирусной инфекцией, чем причиной прогрессирующего повреж­ дения печени [Monsardio У., 1998]. Дальнейшее изучение HDVинфекции с применением методов молекулярной биологии по­ зволит уточнить патогенез гепатита D [Taylor Y.M., 1999].

Эпидемиология HDV-инфекции аналогична таковой при HBV-инфекции.

HDV-инфекция поражает лиц всех групп риска по развитию гепатита В; часто встречается среди инъекционных наркоманов, у медицинских работников, у лиц, которым многократно перели­ вают кровь, и т. д. HDV может распространяться при гомо- и ге­ теросексуальных контактах. Описаны случаи внутрисемейного инфи­ цирования. ВИЧ-инфекция сопровождается реактивацией HDV.

2.3. ВИРУС ГЕПАТИТА С

Вирус гепатита С идентифицирован в 1989 г. группой аме­ риканских исследователей под руководством М. Houghton: бы­ ла клонирована ДНК-копия вируса, вызывавшего парентераль­ ный гепатит ни А ни В у экспериментально инфицированных шимпанзе [Choo Q.-L. et al., 1989], и разработан метод обнару­ жения сывороточных антител к рекомбинантному белку этого вируса [Kuo G. et al., 1989], который был назван вирусом гепа­ тита С (HCV). HCV явился первым вирусом, который удалось идентифицировать на основании расшифровки последователь­ ности нуклеотидов задолго до его выделения и электронно­ микроскопической визуализации.

Структура вирусных частиц. Структура вириона изучена не­ достаточно из-за низкого уровня виремии и отсутствия надеж­ ных клеточных культур для накопления HCV. Лишь в немного­ численных исследованиях HCV был визуализирован при электронной микроскопии [Kaito М. et al., 1994; Shimizu Y.K. et al.,

^96]. Это мелкий (с диаметром сферических вирусных частиц До 50 нм) РНК-содержащий вирус, обладающий липидной обо­ лочкой (инактивация хлороформом).

29

Хронический вирусный гепатит

Показана различная плотность (плавучая плотность в гради­ енте сахарозы) вирусных частиц, выделяемых из сыворотки крови инфицированных людей и шимпанзе - от 1,06 до 1,20 г/см3. Фракции высокой плотности, как полагают, представляют со­ бой комплексы вирионов с иммуноглобулинами. Наличие фрак­ ций вирионов низкой плотности, которые обладают большей инфекциозностью, объясняют связыванием вирусных частиц с сывороточными липопротеинами низкой плотности. Вероятно, липопротеины низкой плотности предохраняют вирус от ней­ трализации антителами и способствуют проникновению вируса в клетки хозяина путем эндоцитоза [Thomssen R. et al., 1993; Major M.E., Feinstone S.М., 1997].

HCV по сравнению с HBV менее устойчив во внешней сре­ де. Он легко инактивируется формалином, ультрафиолетовым излучением, а также нагреванием (при температуре +60 °С в тече­ ние 30 мин, при +100 °С в течение 2 мин), что наряду с низким уровнем виремии обусловливает его более низкую инфекциозность.

Строение генома, организация и процессинг полипептида HCV. Геном HCV представлен однонитевой линейной молеку­ лой РНК положительной полярности протяженностью около 9600 нуклеотидов. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК, а также физико-химические характеристики ви­ руса позволили определить таксономическую принадлежность HCV к семейству Flaviviridae, выделив в отдельный род hepacivirus.

Род hepacivirus близок по свойствам к представителям двух других родов семейства Flaviviridae - flavivirus и pestivirus, вызывающих ряд инфекций у человека и животных (вирусы лихорадки Денге, желтой лихорадки у человека; вирусы куриной холеры, бычьей диареи и др.). В настоящее время к роду hepacivirus, помимо HCV, отнесены также вирусы GBV-A, GBV-B (вызывающие инфекции у приматов) и GBV-C, или вирус гепатита G (HGV), инфицирующий человека [Houghton М., 1996; Robertson В. et al., 1999].

Результаты многочисленных исследований строения генома HCV, строения и свойств белков HCV обобщены в ряде обзо­ ров [Houghton М., 1996; Major М.Е., Feinstone S.М., 1997; De Francesco R., 1999]. Установлено, что геном HCV содержит два некодирующих региона и одну большую открытую рамку считывания, кодирующую структурные и неструктурные белки вириона. Высококонсервативному 5'-некодирующему региону

30

Вирусы хронического гепатита

/о4 1 _ 3 4 4 нуклеотидов) принадлежит роль в инициации транс­ ляции Трансляция открытой рамки считывания ведет к син­ тезу большого полипептида-предшественника в 3010-3033 ами­ нокислот (в зависимости от субтипа вируса). В цитоплазме или эндоплазматическом ретикулуме клетки хозяина полипептид подвергается процессингу (разрезанию), который происходит с участием протеаз хозяина и вируса и ведет к образованию по крайней мере 10 белков (рис. 2.2).

Рис 2 2 Организация и процессинг полипротеина HCV Обозначены места разреза­ ния * - с помощью сигнальной пептидазы клетки хозяина, ♦ - с помощью вирусной серин-протеиназы, * - с помощью вирусной цинк-зависимой Ы52-3-протеиназы (по R р е Francesco, 1999)

Белок нуклеокапсида - core (С) и два белка оболочки вириона - envelop (El и Е2), являющ иеся структурными белками вириона, а такж е небольш ой белок с неизвестной ф ункцией (р7) кодируются регионом у 5'-конца открытой рамки считыва­ ния. Эти белки подвергаются процессингу с помощью сигналь­ ной пептидазы эндоплазматического ретикулума клетки хозяи­ на. Оставшейся большей частью открытой рамки считывания кодируется б неструктурных белков (NS2, NS3, NS4A, NS4B,

31

Хронический вирусный гепатит

NS5A, NS5B), представляющих собой ферменты и регулятор­ ные пептиды. Процессинг этих белков осуществляется двумя вирусными ферментами, в том числе белков NS2/NS3 - с по­ мощью вирусной цинк-зависимой Ы82-3-протеиназы, осталь­ ных неструктурных белков - с помощью серин-протеиназы. Функции 3'-некодирующего региона на другом конце генома, в котором выделяют 3 участка, недостаточно изучены. Один из участков З'-некодирующего региона, обозначенный как "X tail" (98 нуклеотидов), является высококонсервативным и абсолют­ но необходимым для вирусной репликации.

Белки вируса и их функции. Соге-протеин - основной вирус­ ный структурный белок, обладающий РНК-связывающей ак­ тивностью, формирует нуклеокапсид вируса. Он вовлечен в це­ лый ряд клеточных процессов. Именно с соге-протеином связы­ вают выраженность прямого цитопатического эффекта HCV (см. главу 3). Показано, что соге-протеин модулирует транскрипцию и трансляцию некоторых клеточных генов, обладает онкогенным потенциалом в культуре клеток и на модели животных, может влиять на апоптоз (взаимодействие соге-протеина с рецептором В-лимфотоксина, с рецептором фактора некроза опухолиTNF1), а также модулировать контроль иммунной системы, опосредованный апоптозом лимфоцитов. Соге-протеин инги­ бирует транскрипцию вируса гепатита В [Shih С.М. et al., 1993] и репликацию вируса иммунодефицита человека [Srinivas R.V. et al., 1996].

El и E2 белки, посттрансляционно модифицирующиеся путем гликозилирования, являются основными гликопротеинами вирус­ ной оболочки. Эти белки высоковариабельны. С-концевые части белков оболочки вируса гидрофобны и могут принимать участие во взаимодействии с клеточной мембраной. Представляет ин­ терес идентификация на поверхности некоторых типов клеток, включая лимфоциты и гепатоциты, клеточного протеина (CD81), который может связывать Е2 [Pileri P. et al., 1998]. Полагают, что этот белок является рецептором или корецептором для HCV.

Неструктурный белок NS2 в совокупности с доменом NS3 является цинк-зависимой Ы82-3-протеиназой (ферментная ак­ тивность активизируется цинком и ингибируется хелаторами), осуществляющей разрезание NS2/NS3. Биохимическая структу­ ра этого фермента остается неизвестной, что усложняет задачу создания антивирусного агента, ингибирующего его функцию. Неструктурный белок NS3 многофункционален. Помимо части

32

Хронический вирусный гепатит

мы репликации HCV и участия в этом процессе РНК-зависи- мой РНК-полимеразы, а также других ферментов продолжают изучаться благодаря созданию в последние годы доступных экспериментальных моделей гепатита С "in vivo" и "in vitro". Экспериментальные трудности обнаружения цепи РНК с нега­ тивной полярностью обусловлены ее незначительным содержа­ нием в инфицированных клетках по сравнению с (+)цепью РНК, коротким периодом ее жизни, недостаточной специфич­ ностью цепной полимеразной реакции в варианте с обратной транскрипцией (возможность ложноположительных сигналов при детекции негативных цепей РНК). Тем не менее с по­ мощью разработанных в последние годы обладающих высокой специфичностью модификаций полимеразной цепной реакции, а также in situ гибридизации и методов обнаружения антигенов вируса в клетках доказана возможность репликации HCV не только в гепатоцитах, но и в периферических мононуклеарных клетках крови, в нейтрофилах, тромбоцитах, в клетках костно­ го мозга; получены также данные, не исключающие возмож­ ность репликации HCV в других органах и тканях (см. главу 3).

Гетерогенность HCV. Генотипическая классификация. Наи­ более важной характеристикой HCV является его выраженная гетерогенность, по степени которой HCV напоминает вирус иммунодефицита человека. Гетерогенность HCV, как и других РНК-содержащих вирусов, обусловлена особенностями репли­ кации вирусной РНК, которая не сопровождается коррекцией ошибок, а также высоким уровнем репродукции HCV. Показа­ но, что скорость продукции вирусных частиц составляет 10111012 в сутки с очень коротким периодом полужизни вирусных частиц (2,7-7,2 ч для HCV по сравнению с 26,4 ч для HBV) [Zeuzem S., 1999]. Вариабельность, т. е. подверженность мута­ циям, различных участков генома различна: наиболее консер­ вативными являются некодирующие регионы 5' и 3' (что по­ зволяет использовать 5'-некодирующий регион в диагностике с помощью полимеразной цепной реакции), в открытой рамке считывания - Core, наиболее вариабельными - Е1 и Е2 участки. У 5'-конца гена Е2 находится самый гетерогенный участок, кото­ рый был назван гипервариабельным регионом 1 (HNR1) [Hijikata М. et al., 1991; Weiner A.J. et al., 1991]. Установлено, что этот регион (около 90 нуклеотидов) кодирует HVR1 участок белка оболочки вируса (30 аминокислот - 390-420), содержа­ щий основные эпитопы-мишени для нейтрализующих антител

34

Вирусы хронического гепатита_______________________________________________________

rWeiner A.J. et al., 1992]. В E2 генотипа обнаружен еще один гипервариабельный регион [Hijikata М. et al., 1991], содержа­ щий около 21 нуклеотидов (HVR2), кодирующий участок белка оболочки вируса (аминокислоты - 474-480), значение которого

Р.Е., 1999]. До настоящего времени существуют трудности в классификации вариантов HCV, полученных в Юго-Восточной Азии (Таиланд, Вьетнам, Индонезия) и описанных авторами как генотипы 7-11. Однако филогенетический анализ этих ва­ риантов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их как подтипы внутри генотипов 3 и 6, несмотря на то что сте­ пень гомологии между ними значительно меньше, чем между

подтипами, относящимися к другим генотипам [Simmonds Р.Е., 1999].

Генотипы HCV с различной частотой встречаются в разных регионах мира. Основные генотипы - 1, 2, 3 (особенно их под­ типы la, lb, 2а, 2Ь, За) - широко распространены в мире, пре­ имущественно в Америке, Западной Европе, на Дальнем Во­ стоке (с преобладанием 1а в Северной Америке и на севере

35

Хронический вирусный гепатит

Европы, в то время как lb - в Японии, на юге и востоке Евро­ пы). Генотип 4 распространен в Центральной Африке и Сред­ нем Востоке (является основным генотипом в Заире, Египте). Генотип 5 преобладает на юге Африки, генотип 6 с его мно­ жеством вариантов - в Юго-Восточной Азии [Bukh J. et al., 1995]. В России преобладает генотип lb, который составлял в различных регионах от 50 до 83% всех изолятов [Львов Д.К. и др., 1997]. Причины географических различий в распределении генотипов не совсем ясны. Предполагается связь с путями ин­ фицирования [Pawlotsky J.M . et al., 1995]. Однако поскольку филогенетический анализ РНК вируса позволил предположить, что образование основных генотипов HCV произошло 500-2000 лет назад [Smith D.B. et al., 1997], а основные парентеральные механизмы передачи вируса появились относительно недавно, не ясны пути инфицирования вирусом на протяжении многих столетий.

Наличие в сыворотке крови больного вирионов, относящихся к двум или более генотипам HCV, наблюдается редко. Показано, что HCV присутствует в организме хозяина в виде гетероген­ ной популяции близких генетически вирионов - квазивидов [Martell М. et al., 1992], степень гомологии между последова­ тельностями основных консервативных регионов которых до­ стигает 98-100%, но существуют различия, обусловленные то­ чечными мутациями преимущественно в HVR1 генома. Среди квазивидов обычно определяется доминирующий и различное количество подчиненных. На протяжении хронической ин­ фекции происходят быстрые мутации, ведущие к смене домини­ рующего квазивида, избеганию иммунного ответа [Weiner A.J. et al., 1992; Bukh J. et al., 1995].

2.4. ВИРУСЫ ГЕПАТИТА G И TT

HGV, гак же как GBV-A, GBV-B, GBV-C и HCV, относят к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепо­ чечной РНК с позитивной полярностью, по своей организа­ ции подобен РНК HCV, т.е. структурные гены расположены у 5'-области генома, а неструктурные - у З'-конца (см. далее рис. 2.4). Установлено, что HGV-С и HGV имеют высокую гомологичность (86% на уровне нуклеотидов и 95% на уров­ не аминокислот), что позволяет рассматривать их как вариан­ ты одного и того же вируса, для обозначения которого ис­ пользуется термин "HGV".

36

Вирусы хронического гепатита

В качестве маркера для диагностики и изучения эпидемиогепатита G служит PHK-HBV-C/HGV, выявляемая мето- Л°м обратной транскрипции (RT-PCR), при которой синтези-

Д°ется кДНК. Антитела GBV-C/HGV (к оболочечному антиге- V Е2) выявляются у больных гепатитом и здоровых лиц, как правило, в отсутствие PHK-GBV-C/HGV, в связи с чем этот тест не может быть использован как диагностический. В то же время он сохраняет значение для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований

[Михайлов М.И., 1997, Kiyosawa Т., Tanaka Е., 1999].

Вэпидемиологическом отношении гепатит G, как и гепати­ ты В и С, относится к инфекциям с парентеральным путем пе­ редачи, и источником распространения вируса являются боль­ ные острым или хроническим гепатитом G и носители HGV. Вирус можно обнаружить в сыворотке, плазме, мононуклеарных клетках периферической крови [Medejon A. et al., 1996] и слюне [Fabris P. et al., 1997]. Парентеральный механизм зара­ жения может реализоваться при использовании контаминированных кровью шприцев, о чем свидетельствует чрезвычайно вы­ сокое (88,9%) распространение гепатита G среди инъекционных наркоманов. Возможен половой путь заражения. Доказано от­ сутствие вертикального пути передачи.

ВРоссии частота выявления РНК GBV-C колеблется от 2%

вМоскве до 8% в Якутии [Михайлов М.И., 1997]. В регионах мира с высоким распространением гепатитов В и С опреде­ ляется более высокий уровень гепатита G и больший процент лиц-носителей HGV по сравнению с HCV и HBV.

H G V РНК в сыворотке крови выявляется у больных острым вирусным гепатитом (в том числе фульминантным), хрониче­ ским гепатитом, чаще в сочетании с маркерами других вирусов. Случаи моноинфекции наблюдаются редко. Наибольшая часто­ та выявления HGV РНК отмечается при посттрансфузионном гепатите. Обращается внимание на низкую частоту обнаруже­ ния HGV РНК при гепатоцеллюлярной карциноме. Не доказа­

на роль HGV в развитии апластической анемии. Установлено,

что этот вирус не является главной причиной аутоиммунного гепатита.

При изучении HGV-инфекции отмечена малая (мягкая) па­ тогенность этого вируса (в том числе у половины инфицироанных - нормальные показатели аминотрансфераз), что при­ вело к сомнению по поводу гепатотропности HGV. Главными

37