2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

Полуколичественный метод определения каталазы по Kubica

С помощью этого метода МБ можно разделить на 2 группы: с низкой каталазной активностью (высота продукции пузырьков менее 45 мм) и с высокой каталазной активностью (высота продукции пузырьков более 45 мм). К МБ, обладающим низкой каталазной активностью, относятся МБТ, М. bovis, М. marinum, M. avium, М. xenopi и М. malmoense. Другие виды МБ обладают высокой каталазной активностью. М. kansasii по активности каталазы подразделяются на 2 подвида: непатогенные штаммы, продуцирующие колонку пузырьков менее 45 мм, и патогенные штаммы, ассоциирующиеся с заболеванием человека и продуцирующие колонку пузырьков более 45 мм.

Методика выполнения

1.Приготовленную среду Левенштейна–Йенсена разливают по 5 мл в пробирки. При свертывании среды пробирки должны находиться в строго вертикальном положении (без скоса).

2.На горизонтальную поверхность среды засевают 0,2 мл бактериальной суспензии, инкубируют при 35–37 °С в течение 2–3 нед.

3.Готовят свежий раствор перекиси водорода: 0,2 мл пергидроля на 10 мл дистиллированной воды.

4.В пробирку с выросшей культурой добавляют 1 мл раствора перекиси водорода и измеряют высоту колонки пузырьков в миллиметрах после 5-минутного вертикального положения пробирки при комнатной температуре. По высоте колонки пузырьков – более 45 мм или менее 45 мм – определяют степень каталазной активности.

Метод определения термостабильной каталазы (68 °С) по Kubica

Некоторые виды МБ теряют каталазную активность при нагревании культуры до 68°С. К ним относятся MБT, M. bovis, M. gastri. Термостабильную каталазу про-

дуцируют M. kansasii, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. fortuitum и многие другие виды МБ.

Методика выполнения

1.Для приготовления 100 мл фосфатного буфера рН 7,0 берут:

61,1 мл 0,067М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия (9,47 г Na2HPО4 на 1 л дистиллированной воды);

38,9 мл 0,067М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (9,07 г КН2РО4 на 1 л дистиллированной воды).

2.Тестируют хорошо выросшие, изолированные колонии МБ со среды Левенш- тейна–Йенсена.

3.Готовят суспензию МБ в 0,5 мл фосфатного буфера рН 7,0. Пробирку с суспензией помещают в водяную баню с температурой 68 °С на 20 мин. Затем охлаждают суспензию до комнатной температуры и добавляют 0,5 мл свежеприготовленного раствора перекиси водорода (0,2 мл пергидроля на 10 мл дистиллированной воды). Наблюдают за образованием пузырьков или их отсутствием. Пробирки с реагирующим раствором выдерживают в течение 20 мин, прежде чем зарегистрировать отрицательный результат.

190 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Контроль качества

Используют как положительный контроль М. kansasii, как отрицательный – МБТ.

Метод восстановления нитратов по Tsukamura

Метод используется для дифференциации некоторых видов МБ, которые обладают морфологически сходными колониями, одинаковыми скоростью роста и способностью к пигментообразованию. МБТ, M. kansasii, M. szulgai, некоторые непатогенные нефотохромогенные МБ и М. fortuitum имеют положительную реакцию, M. bovis и M. chelonae – отрицательную.

Методика выполнения

1.Культуру выращивают на плотной питательной среде в течение 3–4 нед.

2.Для приготовления М/15 фосфатного буфера рН 7,1 берут:

а) М/15 раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (9,078 г КН2РО4 на 1 л дистиллированной воды);

б) М/15 раствор двухзамещенного фосфорнокислого натрия (11,876 г Na2HPО4 на 1 л дистиллированной воды).

Для получения 100 мл фосфатного буфера рН 7,1 берут 33,4 мл раствора «а» и 66,6 мл раствора «б».

3.Готовят 0,1% раствор нитрата натрия в фосфатном буфере. Навеску в 100 мг

NaNО3 растворяют в 100 мл фосфатного буфера, стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С, хранят в холодильнике. Перед постановкой реакции нагревают до комнатной температуры.

4.Готовят реактив Эрлиха: 2 г парадиметиламинобензальдегида на 100 мл 10% раствора соляной кислоты.

5.10 мг влажной массы испытуемой культуры со среды Левенштейна–Йенсена вносят в пробирку с 1 мл 0,1% раствора нитрата натрия в фосфатном буфере. Инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Добавляют 2 капли реактива Эрлиха и 0,5 мл 10% раствора соляной кислоты. Окрашивание раствора в желтый цвет свидетельствует о восстановлении нитратов.

На получение положительного результата влияет возраст исследуемой культуры (3–4 нед.) и ее количество. В случае получения отрицательного результата рекомендуется повторить реакцию.

Можно также пользоваться следующей модификацией этого теста. В контрольную пробирку с хорошим ростом культуры после определения ее лекарственной устойчивости вносят 1 мл 0,1% раствора нитрата натрия в фосфатном буфере. Инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. В пробирку с реагирующей смесью добавляют 2 капли реактива Эрлиха и 0,5 мл 10% раствора соляной кислоты. Преимущество модифицированного метода заключается в использовании «свежей» культуры в достаточном количестве.

Метод определения арилсульфатазной активности по Wayne

Арилсульфатаза гидролизует связь между сульфатной группой и ароматическим кольцом трикалий фенолфталеин дисульфата, входящего в ростовую среду с образованием свободного фенолфталеина. Наличие свободного фенолфталеина определя-

ется по красному цвету среды, который появляется после добавления щелочи. Быстрорастущие МБ обладают арилсульфатазной активностью, поэтому постановка этого теста существенно помогает видовой идентификации МБ. 3-дневная арилсульфатаза используется главным образом для идентификации потенциально-патогенных быстрорастущих видов. Только M. fortuitum и М. chelonae отщепляют фенолфталеин от трикалий фенолфталеин дисульфата в течение 3 дней. 14-дневная арилсульфатаза может быть использована для идентификации таких видов МБ, как М. marinum,

М. xenopi, М. triviale, М. smegmatis и М. flavescens.

Методика выполнения

1.Готовят среду для выращивания МБ: к 100 мл расплавленного питательного агара добавляют 1 мл глицерина и 65 мг трикалий фенолфталеин дисульфата. Агар разливают в пробирки по 2–3 мл, автоклавируют при 0,5 атм в течение 15 мин и дают застыть в вертикальном положении пробирки.

2.Готовят индикатор – 1М раствор углекислого натрия (5,3 г Na2CO3 на 100 мл дистиллированной воды). Приготовленный раствор хранят в холодильнике.

3.Суспензию культуры засевают по 0,2 мл на поверхность агара, инкубируют при 37 °С в течение 3–14 дней. После окончания инкубации к выросшей культуре добавляют индикатор. Положительный тест – появление малиновой окраски, которая свидетельствует о наличии свободного фенолфталеина.

Метод гидролиза Твина 80 по Wayne

Липазы, которые продуцируют некоторые виды МБ, гидролизуют Твин 80 до олеиновой кислоты и полиоксиэтиленсорбитола. Нейтральный красный в среде с рН 7,0 связан с Твином 80 и имеет янтарный цвет. При гидролизе Твина 80 нейтральный красный освобождается и приобретает свой обычный цвет. Этот метод используется для разделения потенциально-патогенных и сапрофитных МБ. Так, М. gordonae и М. malmoense гидролизуют Твин 80, а М. avium и М. scrofulaceum не гидролизуют его.

Методика выполнения

1. Для приготовления 100 мл М/15 фосфатного буфера рН 7,0 берут:

а) М/15 раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (9,078 г КН2PO4 на 1 л дистиллированной воды);

б) М/15 раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (11,876 г Na2HPO4 на 1 л дистиллированной воды).

Для получения 100 мл фосфатного буфера рН 7,0 берут 38,9 мл раствора «а» и 61,1 мл раствора «б».

2.Берут 0,5 мл Твина 80.

3.Готовят 2 мл 0,1% водного раствора нейтрального красного.

4.Смешивают 100 мл фосфатного буфера, 0,5 мл Твина 80, 2 мл раствора нейтрального красного, разливают по 4 мл в пробирки и автоклавируют 15 мин при 0,5 атм, хранят в холодильнике.

5.Эмульгируют 1 лопаточку исследуемой культуры в пробирке с приготовленным реактивом. Инкубируют при 37 °С. Реакцию читают через 5–10 суток. Реакция считается положительной, если соломенно-желтый цвет изменяется на красный.

192 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Метод определения уреазной активности с применением систем индикаторных бумажек

Способность культур МБ гидролизовать мочевину используется для идентификации как скотохромогенных, так и фотохромогенных МБ. М. scrofulaceum являются уреазаположительными, в то время как М. avium – уреазаотрицательными, что помогает дифференцировать пигментообразующие культуры МАС от скотохромоген-

ных М. scrofulaceum.

Положительная реакция отмечается у быстрорастущих и некоторых медленнорастущих МБ.

Методика выполнения

1.Берут бумажный диск из системы индикаторных бумажек (СИБ), пропитанный раствором мочевины.

2.В пробирку с 0,3 мл физиологического раствора (рН 7,2) вносят 2–3 мг культуры МБ, суспендируют и погружают в нее диск с мочевиной. Инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Под действием фермента мочевина расщепляется до аммиака, и физиологический раствор становится малиново-красным в присутствии индикатора.

Метод определения устойчивости к хлористому натрию

Метод применяется для дифференциации быстро- и медленнорастущих НТМБ. Быстрорастущие МБ устойчивы к 5% хлористому натрию, а медленнорастущие теряют способность расти на этой среде. Из медленнорастущих МБ только М. triviale способны расти в присутствии 5% хлористого натрия. Из клинически значимых быстрорастущих МБ только М. chelonae, подвид chelonae, не растут на этой среде.

Методика выполнения

1.Используют суспензию микобактерий высокой плотности.

2.Готовят среду Левенштейна–Йенсена, содержащую 5% NaCl, и контрольную среду без NaCI.

3.0,1 мл бактериальной суспензии испытуемой культуры засевают на 2 пробирки с хлористым натрием и без него.

4.Инкубируют при 37 °С. Регистрируют результат роста культуры через 4 нед.

Контроль качества

В качестве положительного контроля используют М. fortuitum, отрицательного – МБТ.

Метод восстановления теллурита калия по Kilburn

В основе метода лежит восстановление бесцветного теллурита калия до черного осадка металлического теллура. МАС способны восстанавливать теллурит в течение 3–4 дней, поэтому это свойство используют для отделения этого вида от других нефотохромогенных видов МБ. Некоторые быстрорастущие МБ также могут восстанавливать теллурит в короткие сроки.

Методика выполнения

1.Берут 7-дневную культуру МБ, выросшую в 5 мл жидкой среды Миддлбрука 7Н9. Среда должна быть интенсивно мутной – признак массивного роста культуры.

2.Готовят 0,2% водный раствор теллурита калия (0,1 г К2ТеО3 на 50 мл дистиллированной воды). После того как соль растворится, реактив разливают в пробирки по 2–5 мл и автоклавируют при 120 °С в течение 10 мин. В каждую пробирку с культурой добавляют по 2 капли раствора теллурита калия и ставят в термостат при 37 °С. Наблюдают за культурами в течение 4 дней и более. Положительный результат определяется по появлению черного преципитата металлического теллура.

Контроль качества

В качестве положительного контроля используют М. avium, отрицательного –

М. kansasii.

Метод определения амидазной активности по Taequet

В основе метода лежит способность различных видов МБ использовать в процессе метаболизма определенные амиды. Амидазная активность – постоянное свойство микроорганизмов. Ферментативное разложение амидов сопровождается выделением аммиака, наличие которого определяют с помощью реактива Несслера.

Методика выполнения

1.Для выращивания МБ нужно приготовить синтетическую питательную среду рН 6,9. Берут: пептон – 2 г, агар-агар – 40 г, хлористый натрий – 10 г, однозамещенный фосфорнокислый калий – 4 г, глицерин – 20 мл, дистиллированную воду – до 2 л. Среду разливают в пробирки по 5 мл, автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 мин. Дают остыть при комнатной температуре в наклонном положении пробирок (со скосом).

2.Готовят навески амидов: ацетамид – 1 г, мочевина – 1 г, никотинамид – 0,75 г, пиразинамид – 0,5 г, аллантоин – 0,4 г, сукцинамид – 0,25 г, пропионамид – 0,5 г. Каждый амид растворяют в 25 мл дистиллированной воды, стерилизуют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 30 мин; раствор мочевины стерилизуют через бактериальные фильтры. На поверхность готовой агаровой среды стерильно наносят по 0,5 мл аллантоина и сукцинамида, остальные амиды – по 0,25 мл. Амидам дают впитаться в поверхность среды в течение 2–3 дней при комнатной температуре.

3.Берут реактив Несслера коммерческого производства (Уральский завод химреактивов). Способ приготовления реактива см. в книге «Биохимические методы исследования в клинике» (М.: Медицина, 1968. – 651 с.).

4.На поверхность агаровой среды с различными амидами и в контрольную среду (не содержащую амидов) засевают по 0,2 мл суспензии МБ. При появлении (через 1 или 3–4 нед.) хорошо видимых колоний на всей поверхности среды в пробирки добавляют 0,5 мл реактива Несслера. Реакцию оценивают как положительную по появлению в пробирке ржавой окраски и отсутствию такой в контроле. Результаты следует учитывать сразу после добавления реактива Несслера, так как в дальнейшем могут происходить неспецифические реакции.

194 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Представленные выше биохимические методы идентификации позволяют окончательно установить видовую принадлежность НТМБ. Биохимические свойства лежат в основе определения вида культур, выделенных из патологического материала.

Т а б л и ц а 3

Амидазная активность наиболее часто встречающихся нетуберкулезных микобактерий

Предложенные схемы и сводные таблицы дадут возможность провести идентификацию всех наиболее важных в клиническом отношении нетуберкулезных микобактерий.

Приложение 5

Культуральная диагностика туберкулеза с помощью автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960

1. Материально-техническое обеспечение метода

1.1. Прибор ВАСТЕС MGIT 960

Прибор ВАСТЕС 960 работает на принципах технологии MGIT: индикаторные пробирки после внесения в них диагностического материала инкубируются в приборе, подвергаясь периодическому УФ-тестированию.

Прибор весит 351 кг, его размеры невелики (92х135х85 см), специальных условий для его размещения в лаборатории не требуется. Он состоит из трех секций, вмещающих по 320 пробирок каждая, таким образом, максимальная одновременная загрузка прибора – 960 пробирок. Поскольку скорость роста микобактерий на этой системе достаточно высока, указанная емкость позволяет исследовать в течение года примерно 8000 образцов диагностического материала. Контроль за внесенным в индикаторную пробирку материалом осуществляет встроенный в прибор компьютер. Жидко-кристаллический дисплей и специальные индикаторы на каждой секции дают информацию о наличии положительных и отрицательных посевов.

Важным компонентом системы ВАСТЕС MGIT 960 является пробирка MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) c флуоресцентным индикатором, свечение ко-

торого погашено кислородом. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флуоресцентный компонент, который начинает светиться в луче ультрафиолетового света.

Ускоренный рост микобактерий и снижение контаминации обеспечивается дополнением бульона 7Н9 жидкой питательной добавкой OADC и пятью лиофилизированными антибиотиками PANTA, которые вносят в индикаторную пробирку перед посевом. OADC содержит четыре питательных компонента: олеиновую кислоту, бычий сывороточный альбумин, декстрозу и каталазу. Смесь PANTA включает в себя препараты, подавляющие жизнедеятельность Грам+, Грам– и анаэробных бактерий, а также грибов; она состоит из полимиксина В, амфотерицина В, налидиксовой кислоты, триметоприма и азлоциллина. Прибор ВАСТЕС 960 оценивает пробирку как позитивную, если количество живых микробов в ней достигло 105–106 на 1 мл среды.

Таким образом, прибор ВАСТЕС MGIT 960 осуществляет компьютерный мониторинг состояния бактериальной популяции в обогащенной жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 и сигнализирует о размножении минимального числа микроорганизмов.

196 Культуральные методы диагностики туберкулеза

1.2. Реагенты и расходные материалы

1.2.1. Большую часть необходимых реагентов и аксессуаров можно заказать по каталогу фирмы Becton Dickinson (BD)

MGIT tube, 7 ml (Пробирки MGIT, 7мл)

Пробирки предназначены для культивирования микобактерий с использованием прибора BACTEC 960. В каждой пластиковой пробирке с прикручивающейся крышкой содержится 7мл среды Миддлбрука 7Н9, которую перед инокуляцией следует дополнить питательными добавками и антимикробными веществами для предотвращения контаминации. Инокулятом могут служить предварительно обработанные (разжиженные, деконтаминированные и концентрированные) клинические образцы, за исключением мочи, стерильные биологические жидкости (исключая кровь) и культуры микобактерий. Пробирки также предназначены для определения антибиотикочувствительности микобактерий, исключая пиразинамид. Пробирки поставляются в картонной коробке, содержащей 100 пробирок. Температура хранения проби-

рок 2–25 °С.

MGIT 960 Supрlement (Дополнительный набор)

Набор включает 6 флаконов по 15 мл ростовой добавки OADC, содержащей олеиновую кислоту, бычий альбумин, глюкозу и каталазу, а также 6 флаконов с лиофилизированной смесью антибиотиков PANTA, содержащей полимиксин Б, амфотерицин Б, налидиксовую кислоту, триметоприм и азлоциллин. Каждый набор рассчитан приблизительно на 100 пробирок, температура хранения набора 2–25 °С.

MGIT 960 SIRE Kit

Набор предназначен для определения чувствительности культуры микобактерий к критическим концентрациям стрептомицина, изониазида, рифампицина и этамбутола. Набор содержит по одному флакону каждого из препаратов (стрептомицин, изониазид, рифампицин и этамбутол) в лиофилизированном состоянии, а также 8 флаконов по 20 мл обогатительной добавки MGIT 960 AST supplement (OADC), которая отличается от аналогичной добавки, предназначенной для выявления микобактерий, по количественному соотношению компонентов. Перед добавлением в пробирки MGIT препараты следует растворить в 4 мл стерильной деионизированной воды. Набор рассчитан на 40 тестов, температура его хранения 2–8 °С.

BACTEC MGIT 960 IR Kit

Набор предназначен для определения чувствительности культуры микобактерий к критическим концентрациям изониазида и рифампицина. Набор содержит по одному флакону изониазида и рифампицина в лиофилизированном состоянии и 4 флакона питательной добавки. Перед добавлением в пробирки MGIT препараты следует растворить в 4 мл стерильной деионизированной воды. Набор рассчитан на 40 тестов, температура его хранения 2–8 °С.

MGIT 960 STR 4.0 Kit

Набор предназначен для определения чувствительности микобактерий к высокой концентрации стрептомицина (4 мкг/мл) методом пропорций. Упаковка содержит

1 флакон с лиофилизированным стрептомицином и 2 флакона питательной добавки. Набор рассчитан на 40 тестов, температура его хранения 2–8 °С.

MGIT 960 INH 0.4 Kit

Набор предназначен для определения чувствительности микобактерий к высокой концентрации изониазида (0,4 мкг/мл) методом пропорций. Упаковка содержит 1 флакон с лиофилизированным изониазидом и 2 флакона питательной добавки. Набор рассчитан на 40 тестов, температура его хранения 2–8 °С.

MGIT 960 EMB 7.5 Kit (этамбутол 7.5 мкг/мл)

Набор предназначен для определения чувствительности микобактерий к высокой концентрации этамбутола (7.5 мкг/мл) методом пропорций. Упаковка содержит 1 флакон с лиофилизированным этамбутолом и 2 флакона питательной добавки. Набор рассчитан на 40 тестов, температура его хранения 2–8 °С.

BACTEC MGIT 960 PZA Kit

Набор предназначен для определения чувствительности микобактерий к пиразинамиду. Набор содержит 2 флакона с лиофилизированным пиразинамидом и 6 флаконов питательной добавки. Перед добавлением пиразинамида в пробирки MGIT со сниженным рН (5,9) его следует растворить в 2,5 мл стерильной де­ ионизированной воды. Набор рассчитан на 50 тестов, температура его хранения

2–8 °С.

Пробирки MGIT 960 PZA

Предназначены для определения чувствительности микобактерий к PZA. Пробирка содержит 7,0 мл модифицированного бульона Миддлбрука 7Н9 с пониженным значением рН (5,9). Пробирки поставляются в картонной коробке, содержащей 25 пробирок. Температура хранения пробирок 2–25 °С.

BACTEC MGIT 960 AST стартовый набор

Помимо Руководства пользователя, набор включает:

2 транспортных штатива (на 60 гнезд);

16 держателей для 5 пробирок;

16 держателей для 2 пробирок;

3 держателя для 3 пробирок;

3 держателя для 4 пробирок;

3 держателя для 8 пробирок.

BD BACTEC MGIT 960 AST комплекты держателей

По 3 штуки на 2, 3, 4, 5 и 8 пробирок MGIT.

BACTEC MGIT 960 AST запасные штрихкоды для держателей

По 5 запасных штрихкодов для каждого комплекта держателей (на 2, 3, 4, 5 и 8 про-

бирок MGIT).

198 Культуральные методы диагностики туберкулеза

BACTEC MGIT 960 AST транспортный штатив

MycoPrep

Набор предназначен для разжижения и деконтаминации клинических образцов, направленных для микроскопического и культурального исследований с целью выявления кислотоустойчивых микобактерий. Набор включает:

10 флаконов (по 75 мл или по 150 мл) 2% раствора гидроокиси натрия (NaOH), причем в каждом флаконе содержится стеклянная ампула с порошкообразным муколитиком – N-ацетил-L-цистеином (NALC);

5 пакетов фосфатного буфера.

Непосредственно перед использованием раствора NALC-NaOH (перед добавлением его в равном объеме к исследуемому образцу) ампулу следует раздавить внутри флакона. Каждый пакет с солями для фосфатного буфера растворяют в 0,5 л очищенный воды и предварительно стерилизуют автоклавированием. Температура хранения набора 15–20 °С.

1.2.2. Реагенты для обработки клинических образцов можно приготовить

вусловиях лаборатории

1.Для получения деконтаминирующего раствора, содержащего 2% NaOH (с цитратом натрия), необходимо слить равные объемы 4% NaOH и 2,9% цитрата натрия или растворить в 1 литре дистиллированной воды:

Перед обработкой добавить порошок муколитического (разжижающего) агента NALC в раствор NaOH-цитрат, из расчета 0,5 г на 100 мл. После добавления NALC разжижающая и деконтаминирующая образец смесь NALC-NaOH может быть использована только в течение 24 часов, так как по истечении указанного срока раствор быстро теряет муколитическую активность.

Цитрат натрия добавляется к раствору NaOH, чтобы связать ионы тяжелых металлов, которые могут присутствовать в образце и инактивировать NALC.

При высоком загрязнении образцов посторонней микрофлорой концентрацию гидроокиси натрия в исходном растворе можно увеличить до 3%.

2. Для получения фосфатного буфера в 1 л дистиллированной воды необходимо

Стерилизация буфера проводится в автоклаве при 121 °С в течение 15 минут в емкости с частично открученной крышкой. После остывания раствора при комнатной температуре крышку следует плотно закрутить.

2. Описание метода

2.1. Детекция роста микобактерий с помощью автоматизированной системы бульонного культивирования BACTEC MGIT 960

2.1.1. Подготовка материала для посева

Перед тем как произвести инокуляцию в индикаторную пробирку MGIT, необходимо выполнить предварительную обработку клинического образца с целью его раз-