2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

нических больных туберкулезом характеризует состояние так называемого «бациллярного ядра» в отдельных регионах.

Частота приобретенной лекарственной устойчивости рассчитывается как от-

ношение количества ранее леченных больных туберкулезом с резистентными МБТ ко всем обследованным ранее леченным бациллярным больным за определенный период (как правило, календарный год).

Чрезвычайно полезным для оценки эффективности лечения является показатель нарастания лекарственной устойчивости микобактерий, выделяемых от больных, в

процессе лечения. Он оценивается как доля больных, сохранивших бактериовыделение, у которых была выделена культура с измененным спектром лекарственной чувствительности по сравнению с культурой, выделенной до начала лечения (например, культура, выделенная из материала, собранного до начала лечения, была устойчива к стрептомицину, а культура, выделенная из материала, собранного через 5–6 месяцев лечения, оказалась устойчива к стрептомицину и рифампицину), ко всем больным, сохранившим бактериовыделение и обследованным на лекарственную чувствительность за выбранный период лечения (например, 6 месяцев химиотерапии).

2.7.2. Механизмы развития лекарственной устойчивости

Проблема лекарственной устойчивости является актуальной не только для фтизиатрии, но и для антибактериальной химиотерапии в целом. Выработка устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям является проявлением высокой способности микроорганизмов к адаптации. В ее основе лежит спонтанный мутагенез, происходящий в каждой бактериальной клетке. В результате этого процесса случайным образом возникают повреждения молекулы ДНК – мутации. Вероятность повреждения в результате мутации того или иного гена в значительной степени зависит от его линейной протяженности (размера). Часть возникающих мутаций повреждают гены, ответственные за реализацию антибактериального действия лекарственных веществ, что может приводить к снижению чувствительности мутировавшей клетки к действию соответствующего вещества.

Как уже упоминалось выше, частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости клетки к антибактериальному соединению, во многом зависит от линейных размеров участков ДНК, в которых локализуются гены, ответственные за антибактериальное действие этого вещества: чем больше длина таких участков ДНК, тем выше частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости.

Например, частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости к стрептомицину, механизм антибактериального действия которого связан со связыванием его молекулы со сравнительно значительным участком 30S субъединицы бактериальной рибосомы, составляет для E. coli 10–6, т. е. одна мутантная клетка возникает на 1 млн нормальных клеток. В МБТ, в отличие от других патогенов, имеется только одна копия 16S РНК, поэтому одна мутация в соответствующем гене уже ведет к ЛУ, то есть все рибосомы в полисоме будут устойчивы к ингибиторам белкового синтеза (стрептомицин и другие аминогликозиды). У других микробов множественность копий рибосомальных генов требует для образования клеток, устойчивых к стрептомицину, мутационных изменений в каждой копии.

Частота возникновения устойчивости к рифампицину или офлоксацину значительно меньше и составляет 10–9 и 10–12 соответственно.

Различные гены имеют различное значение для проявления антибактериального эффекта препаратов, поэтому их мутационные повреждения могут приводить к различному уровню устойчивости бактериальной клетки. Уровень устойчивости культуры микобактерий, выделенной от пациента, зависит от доли устойчивых бактерий

вэтой культуре.

Вотличие от других патогенных микроорганизмов микобактерии туберкулеза имеют естественную устойчивость ко многим классам антибактериальных препаратов широкого спектра действия (например, антибиотики бета-лактамного и тетрациклинового ряда), обусловленную особенностями метаболизма: наличием беталактамазы и/или непроницаемостью клеточной стенки.

Устойчивые к антибактериальным препаратам бактериальные клетки возникают

впопуляции инфекционных бактерий в организме хозяина. При воздействии на нее антибактериального препарата чувствительные к нему клетки погибают, а устойчивые бактерии получают селективные преимущества для выживания и распространения в организме.

При применении монотерапии, сниженных доз или укороченных курсов возникает ситуация, способствующая выживанию и распространению лекарственно устойчивых форм. Частота возникновения одновременно двух мутаций, приводящих к устойчивости к двум препаратам, значительно ниже, чем для одной, приводящей к моноустойчивости. Однако при применении второго препарата для лечения инфекции, уже устойчивой к одному из препаратов, и при недостаточной эффективности терапии в организме больного возникнет популяция бактерий, устойчивых уже к двум антибактериальным препаратам. Таким образом, распространение лекарственной устойчивости является следствием неадекватной химиотерапии и считается явлением, сотворенным человеком. Для преодоления возможного умножения лекарственной устойчивости во фтизиатрии применяется химиотерапия не менее чем 4 антибактериальными препаратами.

Проблема развития и распространения лекарственной устойчивости во фтизиатрии обостряется в связи с ограниченностью спектра антибактериальных препаратов, эффективных при этом заболевании, и продолжительностью курса лечения. Прерывание лечения, отказ от приема препаратов, самолечение считаются основными причинами нарастания лекарственной устойчивости к туберкулезу.

2.7.3. Организация исследования лекарственной чувствительности микобактерий

Для исследования лекарственной чувствительности микобактерий требуется соб-

людать определенные стандарты исследований.

Исследование лекарственной устойчивости микобактерий необходимо производить в шкафах биологической безопасности 2-го класса, которые обеспечивают не только защиту оператора, но и сохранность от контаминации биологического объекта.

При получении от больного культур МБТ из различного патологического материала (мокрота, лаважная жидкость, моча, гной, биопсийный и после-

122 Культуральные методы диагностики туберкулеза

операционный материал) необходимо исследование каждого выделенного штамма.

При одновременном получении от больного двух и более культур МБТ из однородного диагностического материала достаточно исследовать один штамм из пробирки с наиболее массивным ростом.

При скудном росте (1–2 колонии в пробирке) допускается собрать бактериальную массу из различных пробирок либо из разных штаммов однородного диагностического материала.

При выделении культуры МБТ в количестве, недостаточном для получения микобактериальной суспензии необходимой концентрации (менее 3 колоний), исследование ЛЧ не производить, культуру пересеять.

Определение лекарственной устойчивости микобактерий необходимо производить только с использованием чистых субстанций противотуберкулезных препаратов.

На результаты тестирования ЛЧ МБТ существенную роль оказывают такие факторы, как используемая для тестирования питательная среда и стабильность вносимых

внее лекарственных препаратов.

Вразличных партиях сред минимальная ингибирующая концентрация лекарственного препарата может существенно различаться. Под воздействием ряда компонентов сред может происходить инактивация некоторых лекарственных препаратов. Например, фосфолипиды в яичных средах инактивируют стрептомицин, D-аланин нейтрализует циклосерин, полиамины подавляют активность этамбутола и т. д. Существенное влияние на стабильность лекарственных препаратов оказывают также условия их стерилизации и хранения.

Многие лекарственные препараты представляют собой соли, таким образом, биологически активные субстанции являются только частью общей массы молекулы, в то время как другие радикалы (например, сульфаты, гидрохлориды и т. д.) могут составлять значительную долю общего веса. В связи с этим при приготовлении питательных сред с препаратами необходимо учитывать количество активного вещества и молекулярную формулу препарата.

Во всем мире в качестве стандартной среды для определения лекарственной чувствительности применяется среда Левенштейна–Йенсена. Эта среда рекомендуется для использования всеми микробиологическими лабораториями противотуберкулезной службы РФ для получения сравнимых результатов. Соблюдение стандартной технологии приготовления питательной среды с препаратами имеет важнейшее значение для получения достоверных результатов тестирования. Как уже указывалось выше, для приготовления питательных сред с целью определения ЛЧ МБТ должны использоваться только химически чистые субстанции препаратов. При приготовлении рабочих растворов с необходимыми концентрациями активной субстанции расчеты количества взвешиваемых навесок следует производить с учетом процента активности препарата, которая может варьировать от серии к серии.

Следует отметить, что особенностью такого противотуберкулезного препарата, как пиразинамид, является его высокая противотуберкулезная активность при сниженных значениях кислотности среды (рН 6,0). В то же время для культивирования МБТ на плотных яичных средах оптимальным является значение рН, близкое к нейтральному. Эти обстоятельства не позволяют использовать стандартные методики для определения ЛЧ МБТ к пиразинамиду на плотных яичных питательных средах.

Большое значение при постановке тестов на ЛЧ МБТ имеет правильная подготовка инокулята. На контрольную и содержащую препарат среды должны вноситься надлежащие количества микроорганизмов. Если число бактериальных единиц слишком мало, стандартного количества инокулята будет недостаточно для определения критической доли устойчивых штаммов. Если число микобактерий слишком велико, рост естественным образом образующихся резистентных штаммов может симулировать лекарственную устойчивость.

Важное значение имеет также возраст культуры, использованной для приготовления посевной суспензии. Тесты на определение лекарственной чувствительности должны проводиться только с активно растущими культурами. Использование старой культуры для приготовления посевной суспензии может привести к искажению результата исследования.

Поскольку в случае использования непрямых методов тестирования ЛЧ МБТ подготовка бактериального инокулята проводится в лаборатории, при приготовлении микобактериальной суспензии для засева может быть выбрано такое соотношение чувствительных и резистентных микроорганизмов, которое не соответствует действительной ситуации в пораженном органе пациента. В связи с этим необходимо правильно производить отбор бактериальной массы для исследования (обязательно выбирать несколько колоний с различных участков пробирки с ростом культуры либо делать смыв со всей поверхности косяка с культурой).

Важное значение при тестировании ЛЧ МБТ имеет также длительность инкубации.

2.7.4. Методы исследования лекарственной чувствительности микобактерий

Для определения ЛЧ МБТ должны использоваться только стандартизованные методы исследования, что позволяет:

правильно вести лечение пациентов;

интерпретировать и сравнивать данные, полученные из различных источников;

проводить оценку уровней лекарственной устойчивости и тенденций, наблюдаемых в разных регионах или странах.

В настоящее время нет единого универсального метода определения ЛЧ МБТ. Имеются культуральные методы с использованием плотных и жидких питательных сред, с полуавтоматической и автоматической детекцией роста микобактерий, а также мо- лекулярно-генетические экспрессные методы.

Выбор того или иного метода определяется традиционно сложившимися методическими подходами, используемыми в данной стране. Для эффективного управления мониторингом, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также для сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в пределах мирового сообщества в масштабах каждой стра­ ны рекомендуется использовать только один из имеющихся унифицированных методов, регламентированный внутренними нормативными документами данной страны.

124 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Все имеющиеся методы определения ЛЧ МБТ можно условно разделить на 2 категории:

методы прямого определения ЛЧ МБТ;

методы непрямого определения ЛЧ МБТ.

При использовании методов прямого определения ЛЧ МБТ мокрота или другие клинические материалы, предварительно обеззараженные и прошедшие гомогенизацию, высеваются непосредственно на среды, содержащие и не содержащие соответствующий препарат. Количество инокулята определяется в зависимости от количества КУМ, определенного при микроскопии мазка.

Методы прямого определения ЛЧ имеют ряд недостатков:

для исследования нельзя использовать образцы диагностического материала, имеющие отрицательный результат микроскопии;

при проведении данного исследования повышается риск контаминации;

может наблюдаться недостаточный рост культуры, не позволяющий сделать достоверные выводы.

При использовании методов непрямого определения ЛЧ МБТ проводится выделение микроорганизмов из клинических образцов при культивировании, а затем на контрольную и содержащую препарат яичную или плотную агаровую среду высевается гомогенная суспензия или культура, выросшая на бульоне.

В литературе описаны три основных классических микробиологических метода непрямого определения ЛЧ МБТ:

 Метод пропорций, предложенный в 1963 г. Canetti, Rist and Grosset и детализированный в 1985 г. Middlebrook and Cohn.

 Метод коэффициента устойчивости, разработанный в 1961 г. Mitchison и др.

 Метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах, модифициро-

ванный в 1970 г. Meissener.

В России наиболее распространенным и традиционно используемым методом оп-

ределения ЛЧ МБТ является непрямой метод абсолютных концентраций на плот-

ной яичной питательной среде Левенштейна–Йенсена. Остальные методы тестирования ЛЧ МБТ являются альтернативными.

2.7.5. Определение лекарственной чувствительности микобактерий непрямым методом абсолютных концентраций

Суть метода заключается в том, что осуществляют дозированный посев тщательно подготовленной микобактериальной суспензии из выросшей культуры МБТ на пробирки с питательной средой Левенштейна–Йенсена, содержащие определенные концентрации противотуберкулезных препаратов и контрольные пробирки без препаратов. Обычно используются несколько концентраций препаратов, устойчивость определяется с помощью минимальной ингибирующей концентрации препарата, которая ингибирует рост всех или почти всех микобактерий, что обычно определяется как наличие 20 или менее колоний возбудителя.

При использовании данного метода удовлетворительные результаты получаются только тогда, когда:

стандартизовано количество инокулята;

критическая концентрация препарата была стандартизована по штаммам возбудителя дикого типа.

Непрямой метод абсолютных концентраций характеризуется тем, что:

позволяет выявить устойчивость возбудителя туберкулеза как к основным, так и к резервным противотуберкулезным препаратам;

выполняется с использованием чистой культуры клинического изолята микобактерий;

период определения ЛЧ МБТ составляет 3 (4) недели;

заключение о результатах определения ЛЧ МБТ поступает к лечащему врачу не ранее чем через 2–2,5 месяца после посева диагностического материала.

Приготовление питательных сред с препаратами

Среды для исследования лекарственной чувствительности должны содержать точные концентрации антибактериальных препаратов, соответствующие их активности. Поэтому при приготовлении растворов препаратов необходимо учитывать их антибактериальную активность. Показатели антибактериальной активности должны быть указаны в паспорте к препарату.

Для приготовления растворов используйте только химические субстанции, в паспорте к которым указаны их антибактериальная активность и сроки годности.

Храните субстанции препаратов строго в соответствии с рекомендациями производителя.

Не используйте субстанции с истекшими сроками годности!

Для определения лекарственной чувствительности к лекарственным препаратам в лаборатории должны иметься поверенные весы, позволяющие производить взвешивание с точностью до 0,2 мг, что обеспечит точность навески препаратов с погрешностью не более ±1,5%.

При хранении разведенных препаратов при температуре +5 °С и выше более 6 часов может произойти снижение их активности. Поэтому растворы необходимо готовить непосредственно перед приготовлением сред. В лабораториях, имеющих морозильные камеры, поддерживающие температуру ниже 20 °С, возможно хранение разведенных препаратов в течение 6 месяцев при условии недопущения их оттаивания и повторного замораживания. Такая технология дает определенные преимущества: приготовление большего объема раствора позволяет взвешивать большую навеску препарата, что уменьшает ошибку взвешивания и потери вещества при взвешивании. В случае замораживания раствора препарата он должен быть разлит по криопробиркам в объеме, необходимом для добавления в одну порцию среды.

Для исследования лекарственной чувствительности применяется плотная яичная среда Левенштейна–Йенсена. После добавления препарата в среду необходимо тщательно ее перемешать, не допуская образования пузырьков и пены и обеспечивая равномерное распределение препарата в среде. Свертывание среды с препаратом должно проводиться в тех же условиях, что и среды без препарата – коагуляция проводится при 82–83 °С в течение 40 минут.

126 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Внабор сред для исследования лекарственной чувствительности входят: контрольная среда (без препаратов), среды, содержащие ПТП, а также среды с веществами, применяемыми для видовой идентификации микобактерий.

С целью снижения экономических затрат на одно исследование определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза непрямым методом абсолютных концентраций рекомендуется проводить к одной, критической концентрации для каждого из исследуемых противотуберкулезных препаратов, определяемой как предельная или критерий устойчивости. Штаммы, которые культивируются при более высоких, чем критическая, концентрациях препарата, относят к лекарственноустойчивым.

Втаблице 6 указаны критические концентрации противотуберкулезных препаратов, к которым в обязательном порядке должно проводиться исследование ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций.

Т а б л и ц а 6

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов для определения лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна–Йенсена

Примечание. Выделенные жирным шрифтом препараты составляют обязательный набор противотуберкулезных препаратов I ряда, к которым определяется ЛЧ МБТ. Тестирование ЛЧ МБТ к остальным препаратам рекомендуется проводить при наличии резистентности к основным противотуберкулезным препаратам.

*Критические концентрации препаратов II ряда носят ориентировочный характер. В настоящее вре-

мя критерии определения ЛЧ МБТ к ПТП II ряда остаются нечеткими и спорными.

Таким образом, комплект для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза должен включать в себя контрольную пробирку, не содержащую препаратов, и пробирки с препаратами в критических концентрациях, указанных выше (см. табл. 6). Помимо этого, в комплект для тестирования ЛЧ МБТ должны быть включены: пробирка с добавлением салициловокислого натрия в концен-

трации 1000 мкг/мл и пробирка с ТСН (thiophene-2-carboxylis acid hydrazide) в кон-

центрации 2 мкг/мл. Наличие двух последних пробирок необходимо для проведения

обязательной первичной идентификации микобактерий, выполняемой в ходе тестирования ЛЧ МБТ.

Все среды, входящие в набор для тестирования одного штамма, должны гото­ виться из одной партии среды Левенштейна–Йенсена в один день!

Схемы разведений противотуберкулезных препаратов и методика приготовления питательных сред с препаратами изложены в Приложении 3.

Приготовление и засев микобактериальной суспензии

Подготовка к выполнению процедуры приготовления и засева микобактериальной суспензии включает в себя следующие подготовительные операции.

Проверенные и отобранные для тестирования ЛЧ культуры микобактерий расставляют в штативе в порядке номеров (номера отобранных культур заносят в лабораторный журнал регистрации лекарственной чувствительности выделенных культур).

Необходимо также заранее расставить в штативах наборы питательных сред для каждой из исследуемых культур. На каждой пробирке со средой надписывают номер культуры и название препарата. Для удобства последующего считывания результатов исследования ЛЧ рекомендуется выполнять надписи на верхней части пробирки, с той ее стороны, где находится скос питательной среды; кроме того, пробирки из каждого набора сред следует размещать в штативах в одинаковой определенной последовательности (в соответствии с графами лабораторного журнала).

Организация рабочего места для приготовления и засева микобактериальной суспензии в ходе постановки тестов на ЛЧ МБТ представлена на рис. 35.

Рис. 35 Рабочее место для приготовления и засева микобактериальной суспензии

128 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Приготовление микобактериальной суспензии

Приготовление микобактериальной суспензии является чрезвычайно важным компонентом определения ЛЧ микобактерий.

Для приготовления посевной суспензии микобактериальную массу (10–20 мг) из нескольких колоний отбирают серебряным шпателем или специальной бактериологической лопаточкой из нихрома (платины).

В шкафах биологической безопасности 2-го класса шпатели и лопаточки реко­ мендуется прожигать в электрических стерилизаторах для металлических инс­ трументов (печках для обжига петель)! (рис. 36).

При отсутствии в лаборатории указанной печки рекомендуется при тестировании ЛЧ заранее подготовить требуемое для постановки опыта количество стерильных лопаток (по числу исследуемых культур). Для отбора микобактериальной массы можно также использовать стерильную одноразовую бактериологическую петлю.

Печка для обжига микробиологических петель (Bacti-Cinerator) Рис. 36

Существует несколько способов приготовления суспензии.

1.Собранную биомассу помещают в сухую толстостенную пробирку. Стеклянной палочкой тщательно растирают культуру микобактерий и по каплям добавляют 2–3 мл физиологического раствора.

2.Микобактериальную массу помещают в толстостенную пробирку из боросиликатного стекла с завинчивающейся пробкой со стерильными стеклянными бусами и стерильным физиологическим раствором с добавлением 0,05% Твина 80 и встряхивают на встряхивателе типа Vortex (рис. 37) в течение 20–25 секунд.

Рис. 37 Встряхиватель Vortex-Genie-2

3.Микобактериальную массу помещают в толстостенную пробирку с завинчивающейся пробкой со стерильными стеклянными бусами и стерильным физиологическим раствором. Уровень жидкости в пробирке не должен превышать уровня бус (приблизительно 1 мл). Суспензию обрабатывают на встряхивателе типа Vortex в течение 120–150 секунд. После окончания встряхивания в пробирку доливают еще 1–2 мл стерильного физиологического раствора.

ВНИМАНИЕ! Процедура приготовления суспензии приводит к образованию инфекционного аэрозоля! Она должна проводиться только с использованием толстостенных (предпочтительно боросиликатных) пробирок без видимых повреждений!

При встряхивании суспензии на встряхивателе типа Vortex должны использоваться герметично закрывающиеся пробирки с завинчивающимися крышками! Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности!

Приготовленной суспензии дают отстояться в течение 15–30 минут и полученный супернатант отсасывают стерильной пипеткой, стараясь забирать только верхний слой жидкости и оставлять в пробирке крупные частицы нерастертой культуры.

130 Культуральные методы диагностики туберкулеза