2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

В ряде случаев некоторые микроорганизмы, загрязняющие посевы, обладают способностью разлагать составные ингредиенты среды с образованием кислоты; это приводит к снижению pH-среды. На такой среде микобактерии не растут, и такие пробирки подлежат удалению.

Посевы с частичным загрязнением желательно выдержать до окончания срока инкубации или до развития хотя бы нескольких колоний микобактерий, так как позднее появление загрязнения не исключает роста M. tuberculosis. В таких случаях необходимо сделать мазок, окрасить его по методу Циля–Нильсена и при наличии кислотоустойчивых микобактерий попытаться обработать выросшую культуру 3–4% раствором серной кислоты, а после отмывания ее изотоническим раствором хлористого натрия вновь засеять осадок на питательные среды.

Во всех случаях получения роста во избежание неверного результата ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дается только после микроскопии мазка из выросших колоний, окрашенного по методу Циля–Нильсена.

Характеристика колоний M. tuberculosis

Вирулентные культуры микобактерий туберкулеза обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту (рис. 31). Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна– Йенсена.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы).

При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию.

При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Цилю–Нильсену, обнаруживаются яркие малиново-крас- ные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами. При культивировании на жидких средах или в условиях повышенной влажности

M. tuberculosis образуют скоп-

ления или переплетения в виде войлока или кос – феномен «корд-фактора» (рис. 32).

Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–10 (чаще 1–4) мкм, шириной 0,2–0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами. Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В моло-

дых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.

Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом в течение 40–45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5–10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах.

Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток. Некоторые из них грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены, и они редко образуют жгутообразные скопления (кордфактор, как правило, отсутствует). Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза R-форме. Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерии имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

Окончательное заключение о принадлежности выделенной культуры к комплексу M. tuberculosis можно сделать только после проведения первичной дифференциации культуры, выполняемой в ходе постановки теста на ЛЧ МБТ. При необходимости проводится дальнейшая идентификация выделенной культуры, позволяющая отнести микобактерии к тому или иному виду.

Учет результатов посева

При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерий, отвечающих определенным характеристикам, а именно:

появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее чем через 3– 4 недели инкубации,

наличие колоний характерной морфологии и окраски,

102 Культуральные методы диагностики туберкулеза

микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по методу Циля–Нильсена,

следует произвести количественную оценку интенсивности роста. Интенсивность роста обозначают по 3-балльной системе (рис. 33): (1+) – 1–20 КОЕ (скудное бактериовыделение); (2+) – 21–100 КОЕ (умеренное бактериовыделение); (3+) – >100 КОЕ (обильное бактериовыделение).

Окончательная величина КОЕ (число колониеобразующих единиц), регистрируе­ мая как итоговый показатель интенсивности роста, высчитывается как суммар­ ное по результатам подсчета числа колоний, выросших во всех пробирках. Одно-

временно рекомендуется зарегистрировать число КОЕ, выросших в каждой из пробирок с разными питательными средами.

Пробирки с различной интенсивностью роста МБТ на среде Финна-II Рис. 33

Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в картотеку. При наличии компьютерной базы данных полицевого учета результаты исследования хранятся и в электронном формате.

2.6. Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса, видовая идентификация микобактерий

2.6.1. Предварительная идентификация комплекса M. tuberculosis (родовая идентификация)

Алгоритм первичной идентификации комплекса M. tuberculosis

В бактериологических лабораториях всех уровней должно проводиться определение принадлежности выделенных или доставленных из лаборатории 1-го уровня культур микроорганизмов.

На основании:

скорости роста бактерий (в случае исследования культур, полученных из другой лаборатории, эти данные должны быть получены из сопроводительного листа) – более 10 дней;

морфологии и окраски колоний;

результатов исследования мазков, приготовленных из выделенной культуры и окрашенных по Цилю–Нильсену,

врач-бактериолог делает заключение о принадлежности культуры к комплексу микобактерий туберкулеза (МБТ), делает соответствующую отметку в графе «Комментарии» журнала регистрации исследований и выдает ответ по результату культурального исследования.

При просмотре посевов проводится внимательное изучение всех выросших культур. На основании морфологических признаков колоний осуществляется предварительное разделение культур на относящиеся к M. tuberculosis complex, на нетуберкулезные микобактерии и родственные таксоны.

Колонии МБТ на большинстве питательных сред выглядят сухими, светло-кремо- вого цвета, шероховатыми (R-форма), толстыми, приподнятыми в центре, с узловатой или морщинистой поверхностью и неровными краями (напоминают сморчки или кочан цветной капусты (рис. 29, 31, 33, 34).

Рис. 34 Колонии M. tuberculosis на среде Левенштейна–Йенсена, ×5

104 Культуральные методы диагностики туберкулеза

На некоторых питательных средах (среда «Новая», Финна-II, лиофилизированная среда Левенштейна–Йенсена) или при обработке диагностического материала 1% раствором серной кислоты (без последующей нейтрализации) колонии выглядят полушаровидными, гладкими (S-форма), мягкими, влажными, иногда слегка складчатыми. Рост культуры МБТ характеризуется как пышный – эугонический. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы).

M. bovis на среде Левенштейна–Йенсена показывает стелющийся дисгонический рост.

Колонии большинства НТМБ морфологически не сходны с МБТ. Сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний. Они бывают гладкие, круглые, влажные, блестящие, куполообразные, маслянистые. Хорошо эмульгируются в воде. Иногда могут иметь промежуточную форму. Колонии кремового цвета М. fortuitum,

M. chelonae, М. kansasii и М. terrae complex бывают сухие и морщинистые, поэтому их иногда ошибочно принимают за МБТ. Окраска колоний НТМБ может быть от белого, телесного и кремового цвета до слабо-желтого, желтого и оранжевого. Рост культуры НТМБ может быть пышным или стелющимся, выпотевающим – дисгоническим.

Морфологически колонии родственных микроорганизмов отличаются от колоний МБТ, однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза R-форме. Поскольку НМТБ также могут вызывать заболевания человека (микобактериозы), они также подлежат выборке для дальнейшей идентификации.

Главной отличительной особенностью рода микобактерий является строгая кислото-, щелоче- и спиртоустойчивость, поэтому первой ступенью идентифика-

ции является микроскопия всех выделенных культур с окраской мазков по Цилю– Нильсену.

Методика выполнения

1.Приготовить мазки из всех культур, отобранных при просмотре посевов.

2.Окрасить мазки по методу Циля–Нильсена.

3.Провести микроскопию мазков.

При окраске по Цилю–Нильсену кислотоустойчивые МБ выглядят красными на синем фоне. Микобактерии имеют вид тонких слегка изогнутых палочек или коротких, длиной 1–10 (чаще 1–4) мкм, шириной 0,2–0,6 мкм, гомогенных или зернистых с незначительно закругленными концами. В мазках культуры МБТ, выросшей на полужидкой или жидкой среде, можно увидеть микроколонии МБ в виде кос и жгутов, феномен корд-фактора (рис. 32). Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.

При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию.

Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может со-

держать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом в течение 40–45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться солянокислым спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5–10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах. При микроскопии клетки некоторых из НТМБ выглядят грубее, толще, иногда они менее интенсивно окрашены, и редко образуют жгутообразные скопления (корд-фактор, как правило, отсутствует). Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерии имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

При просмотре мазка следует обратить внимание на морфологические особенности палочек и расположение их в препарате. НТМБ в мазке из культуры могут располагаться в виде частокола, паркета или иметь форму коккобацилл. Несмотря на то что морфологическая характеристика палочек может ассоциироваться с определенным видом МБ, она не является основанием для видовой идентификации.

Культуры, окрашенные по Цилю – Нильсену положительно, относятся к роду микобактерий и подлежат дальнейшему изучению.

На основании морфологии колоний и положительной окраски мазка из культуры выдается ответ о выделении M. tuberculosis.

Группа родственных микроорганизмов (нокардии, родококки и др.) отличается частичной или слабой кислотоустойчивостью. В мазке можно одновременно встретить красные и синие палочки или фиолетово-синие коккобациллы. Морфологически в мазке из культуры они представлены в виде мицелия, фрагментирующегося на палочки, или крупных полиморфных палочек (таблица 3).

Для дифференциации рода микобактерий и родственных таксонов кроме вышеописанного теста дополнительно можно использовать окраску мазка по методу Грама.

106 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Микобактерии имеют очень слабую окраску по Граму. Нокардии, родококки и коринебактерии хорошо воспринимают окраску по Граму – грамположительные.

На основании тинкториально-морфологических свойств и скорости роста проводится определение рода выделенной культуры. У родственных микроорганизмов отмечается слабая или частичная кислотоустойчивость, быстрый рост на простых и яичных средах, выраженная окраска по методу Грама и значительный полиморфизм при микроскопическом исследовании мазка. Нокардии и родококки не имеют важного клинического значения и могут изучаться в научных лабораториях.

Род микобактерий характеризуется строгой кислотоустойчивостью при окраске по методу Циля–Нильсена и слабой окраской по Граму. В мазке микобактерии представлены в виде длинных,

тоненьких или коротких палочек. Микобактерии характеризуются медленным ростом при посеве диагностического материала на яичные среды.

2.6.2. Дифференциация M. tuberculosis complex от нетуберкулезных микобактерий

Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий должна проводиться в лабораториях 2-го и 3-го уровня, проводящих исследования лекарственной чувствительности. Культуры, отнесенные по морфологическим свойствам к микобактериям туберкулезного комплекса, необходимо дифференцировать от нетуберкулезных микобактерий.

В работе лаборатории встречаются культуры, которые по морфологическим признакам не укладываются в характеристику M. tuberculosis, но показывают кислотоустойчивые свойства при окраске мазка. И наоборот, при внешнем сходстве колоний с колониями M. tuberculosis микроскопическая картина (мелкие палочки, коккобациллы) вызывает сомнения в принадлежности культуры к этому виду. В подобных случаях нельзя выдавать ответ о выделении M. tuberculosis до проведения дифференциальной диагностики с НТМБ.

При первичном выделении культуры из урогенитального диагностического материала следует также выдавать положительный ответ только после дифференциальной диагностики. Это объясняется не только тем, что подобный материал имеет наиболее высокую вероятность загрязнения микобактериями окружающей среды, но и тем, что сапрофитные МБ могут быть нормальной флорой человека.

Следует с особым вниманием выдавать ответ на впервые выделенную культуру из детского диагностического материала, так как врач несет большую ответственность за выдачу ложноположительного результата исследования у ребенка.

Разделение микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ основано на их культуральных свойствах и способности расти на дифференциально-диагности­ ческих средах.

Бактериологическая характеристика микобактерий туберкулеза

1.На среде Левенштейна–Йенсена образуют сухие колонии с неровными краями, цвета слоновой кости.

2.Рост только при 35–37 °С.

3.Рост на плотных питательных средах не ранее 3 недель. Рост субкультуры может появиться через 10–14 дней.

4.Отсутствие роста на среде с салициловым натрием или паранитробензойной кислотой (ПНБК).

Дифференциально-диагностические среды

Среда Левенштейна–Йенсена, содержащая 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл салицилового натрия

Реактивы

1.Среда Левенштейна–Йенсена 300 мл (до свертывания).

2.Натрий салициловый.

Методика выполнения

Раствор 1. Приготовить навеску натрия салицилового 500 мг и добавить 5 мл дистиллированной воды, получаем разведение 100 000 мкг/мл.

Раствор 2. К 2 мл раствора № 1 прибавить 2 мл дистиллированной воды, получаем разведение 50 000 мкг/мл.

Приготовленные растворы натрия салицилового (№ 1 и № 2) в пробирках подо­ греть над пламенем горелки до кипения и дать остыть до комнатной температуры. По 1 мл раствора № 1 и № 2 добавить в две колбы с 99 мл среды Левенштейна–Йенсе- на и тщательно размешать. Получаем рабочее разведение натрия салицилового соответственно 1000 и 500 мкг/мл. Контрольную среду без препарата готовить одновременно с опытными средами.

Среду с салициловым натрием в двух разведениях и контрольную среду разлить в пробирки по 5 мл и стерилизовать при 85 °С в течение 45 мин.

Среда Левенштейна–Йенсена, содержащая 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты (ПНБК)

Реактивы

1.Среда Левенштейна–Йенсена 200 мл (до свертывания).

2.Паранитробензойная кислота.

3.4% раствор едкого натра.

4.10% раствор соляной кислоты.

5.Индикаторные бумажки.

Методика выполнения

Навеску ПНБК (50 мг) хорошо растереть в стерильной ступке, добавить 5 мл дистиллированной стерильной воды и 20–24 капли 4% раствора едкого натра до получения рН 8,0 (по индикаторной бумажке). Затем с помощью 10% раствора соляной кислоты довести рН до 7,0. Приготовленный раствор добавить к 95 мл среды Левенштейна–Йенсена, тщательно размешать. Опытную и контрольную среду разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать при температуре 85 °С в течение 45 мин.

Для разделения микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезных микобактерий 0,2 мл бактериальной суспензии исследуемой культуры в стандартном

108 Культуральные методы диагностики туберкулеза

разведении (суспензию, соответствующую по оптической плотности стандарту мутности № 5, развести в 10 раз), засеять на среду с салициловым натрием (салицилатный тест) или на среду с ПНБК и в контрольную пробирку. Определение способности роста МБ на одной из этих диагностических сред проводится одновременно с определением их лекарственной устойчивости.

Микобактерии туберкулезного комплекса не растут на средах с добавлением са­ лициловокислого натрия или ПНБК.

Однако около 10% культур МБТ дают незначительный рост на среде с 500 мкг/мл салициловокислого натрия. Культуры же НТМБ хорошо растут в присутствии этой концентрации салициловокислого натрия. В то же время некоторые культуры НТМБ на среде с 1000 мкг/мл салицилового натрия имеют очень слабый пленочный рост, который иногда может остаться незамеченным, тогда как культуры МТБ не дают роста на среде с этой концентрацией вещества. Чтобы избежать диагностических ошибок, следует использовать среду с салициловокислым натрием в концентрациях 500 и 1000 мкг/мл, в сомнительных случаях увеличивать срок инкубации до 4 недель и проводить тщательный осмотр поверхности среды. Наличие стелющегося роста культуры расценивается как положительный результат.

В некоторых случаях при постановке салицилатного теста наблюдается почернение, побурение среды с салициловым натрием без изменения цвета среды в контроле. Способность вызывать деградацию салицилового натрия является отличительной особенностью M. fortuitum и M. chelonae.

Дифференциальная диагностика микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезных микобактерий представлена в таблице 4.

На основании отсутствия роста на диагностических средах с салициловым натрием или ПНБК, образования сформированных непигментированных колоний в течение 3–4 недель

при температуре 37 °С исследованную культуру можно отнести к комплексу микобактерий туберкулеза.

2.6.3. Видовая идентификация микобактерий туберкулезного комплекса

Видовая идентификация микобактерий туберкулезного комплекса должна проводиться во всех лабораториях второго и третьего. Наиболее актуальными представителями этого комплекса, встречающимися в наших регионах, являются М. tuberculosis,

M. bovis и M. bovis-BCG.

Их видовая идентификация основана на фенотипической характеристике и ряде биохимических тестов.

Определение нитратредуктазы

Для дифференциальной диагностики микобактерий туберкулезного комплекса применяется реакция восстановления нитратов в нитриты. Сущность метода заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного из нитрата нитрита, который дает цветную реакцию (желтое или красное окрашивание в зависимости от применяемого метода).

Метод определения нитратредуктазы по Гриссу

Для определения способности микобактерий восстанавливать нитраты их культуру выращивают на плотной яичной среде Левенштейна–Йенсена с добавлением нитрата калия или нитрата натрия в количестве 1 г на 1 л готовой среды.

Реактивы

1) Среда Левенштейна–Йенсена.

Среду Левенштейна–Йенсена готовят в соответствии со стандартной прописью и способом приготовления. В готовую к свертыванию среду вносят нитрат калия или натрия из расчета 100 мг на 100 мл среды. Перед посевом в пробирки со средой вносят по 0,2–0,3 мл физиологического раствора или любой жидкой питательной среды (желательно после этого выдержать пробирки в течение суток в горизонтальном положении).

2)Приготовление реактива Грисса:

a)при использовании готового реактива 7,5 г вещества растворяют в стерильной дистиллированной воде; раствор может храниться в холодильнике, в посуде из темного стекла, до 2 недель;

б) при приготовлении реактива Грисса непосредственно в лаборатории его готовят на основе 5-нормального раствора ледяной уксусной кислоты (143 мл ледяной уксусной кислоты довести дистиллированной водой до 500 мл).

Раствор А: 2 г сульфаниловой кислоты растворить в 250 мл 5N уксусной кислоты. Раствор Б: 1,25 г 1-нафтиламина (α-нафтиламина) растворить в 250 мл 5Н уксус-

ной кислоты.

Растворы А и Б могут храниться в посуде из темного стекла в холодильнике 1 год (или до появления осадка). Перед употреблением растворы А и Б смешиваются в равных объемах. Полученный реактив Грисса используют сразу.

Методика выполнения

0,2 мл разведенной в 10 раз суспензии клинического изолята микобактерий туберкулеза с оптической плотностью, соответствующей стандарту № 5, засевают в про-

110 Культуральные методы диагностики туберкулеза